1 Изучение физико-химических свойств и разработка методик контроля качества мареннина
MS является новым БАВ, поэтому для проведения контроля качества требуется разработать необходимые аналитические методики. Методики контроля качества условно можно разделить на 2 группы:
- методики контроля качества, регламентируемые Государственной фармакопеей XIII издания. Показатели качества по данным методикам определяются в соответствии с общими фармакопейными статьями и не подлежат валидации;
- разрабатываемые методики контроля качества. Данные методики разрабатываются или модифицируются на основании физико-химических методов, предложенных общими фармакопейными статьями, таких как хроматография, титриметрия и спектрофотометрия в УФ- и видимой областях. Данные методики подлежат валидации.
1.1 Описание объекта исследования
Объектом исследования являлся лабораторный образец мареннина - жидкого экстракта из микроводорослей (код MS). Поставщик: MIAL, Германия.
Характеристика MS: стерильный раствор в ампулах по 10 мл, содержание пигмента 0,8 г/л, рН 5,5 – 7,0.
Условия хранения: беречь от света и тепла, хранить при комнатной температуре от 4 до 30 °С.
1.2 Методики контроля качества MS, регламентируемые ГФ XIII
1.2.1 Внешний вид
Агрегатное состояние лекарственного вещества имеет большое значение для характеристики его качества; давно известна взаимосвязь агрегатного состояния вещества с его химической и фармакологической активностью.
В зависимости от условий технологического процесса агрегатное состояние субстанции БАВ может быть различным. Особенно это относится к сложным субстанциям БАВ, состоящим из нескольких индивидуальных веществ. Как правило, такие субстанции включают в себя несколько десятков веществ.
Характеризуя цвет подобных субстанций, ГФ XIII издания иногда указывает на возможность его изменения. Таким образом, обращается внимание на нестабильность и возможность изменения химической структуры вещества под влиянием факторов окружающей среды, влекущих за собой изменение внешнего вида.
Внешний вид (цвет, запах) MS определяли в соответствии с ГФ XIII, т. 1, ОФС.1.1.0001.15 «Правила пользования фармакопейными статьями».
MS представляет собой прозрачную маловязкую жидкость темно-синего цвета со слабым специфическим запахом и вкусом. При освещении ярким светом наблюдается флюоресценция красного цвета.
1.2.2 Растворимость
В ГФ XIII издания под растворимостью подразумевают свойство вещества растворяться в разных растворителях, принятых Государственной фармакопеей. Показатели растворимости в разных растворителях является обязательным разделом НД. Для обозначения растворимости лекарственных веществ в ГФ XIII, т. 1, ОФС.1.2.1.0005.15 приняты семь условных терминов («очень легко растворим», «растворим», практически нерастворим» и др.), которые определяют соотношение объема растворителя к одной весовой части лекарственного вещества и при характеристике растворимости необходимо придерживаться приведенной терминологии.
В первую очередь необходимо определить растворимость вещества в воде, далее в ряде растворителей (чаще – в 95 % спирте, хлороформе, эфире, реже – в кислотах и щелочах).
Растворимость вещества является одной из характеристик чистоты, так как изменение растворимости указывает на присутствие или появление в процессе хранения менее растворимых примесей и, таким образом, характеризует изменение его качества.
У некоторых лекарственных веществ растворимость изменяется под влиянием факторов окружающей среды (под действием углекислого газа, кислорода воздуха, света, влаги и т.д.), поэтому необходимо в процессе хранения изучить влияние вышеперечисленных факторов на растворимость.
Определение растворимости MS проводили по методике, указанной в
ГФ XIII, т. 1, ОФС.1.2.1.0005.15 «Растворимость». Термин «Растворимость» для характеристики жидкостей заменяется на термин «Смешиваемость». Результаты определения смешиваемости представлены в таблице 1.
Таблица 1 – Смешиваемость MS
№ п/п Растворитель Результат
1 Вода Очень легко смешивается
2 Спирт этиловый 96 % Легко смешивается
3 Метанол Смешивается
4 Ацетонитрил Смешивается
5 Хлороформ Практически не смешивается
6 Гексан Практически не смешивается
1.2.3 Определение pH
Водородным показателем (рН) называется отрицательный десятичный логарифм активности ионов водорода: pH= - lgaH+
Измерение рН заключается в сравнении потенциала индикаторного электрода, погруженного в испытуемый раствор, с потенциалом того же электрода в стандартном буферном растворе с известным значением рН.
Для определения рН нами использован потенциометрический метод, который заключается в измерении ЭДС элемента, состоящего из двух электродов: индикаторного, потенциал которого зависит от активности ионов водорода, и электрода сравнения - стандартного электрода с известной величиной потенциала.
В качестве индикаторных электродов для измерения рН нами использован стеклянный электрод. Проведена подготовка рН-метра и электродной системы согласно инструкции по эксплуатации. Определение рН проводили при 25 ± 2 0С. Снятие показания рН проводили после окончательного установления значения.
Методика определения. Около 10 мл MS помещали в химический стакан вместимостью 25 мл, перемешивали.
pH полученного раствора снимали на рН-метре «рН METER pH 410 Аквилон».
Результаты проведенного исследования приведены в таблице 2.
Таблица 2 – Значения рН MS
№
п/п Наименование образца рН раствора MS
1 №1 6,38
2 №2 6,37
3 №3 6,39
Результаты определения рН раствора показали, что исследуемые образцы MS имеют рН от 6,37 до 6,39 таким образом, в проект НД в раздел «pH раствора» может быть включена норма:
рН от 6,3 до 6,4 (неразбавленный MS).
1.2.4 Определение плотности
Плотность MS определяли весовым методом, используя пикнометр, в соответствии с Европейской Фармакопеей 7,0, п. 2.2.5.
В предварительно высушенный до постоянной массы пикнометр помещали образец MS при температуре 20 °С и доводили той же жидкой субстанцией до метки. Результаты двух параллельных определений относительной плотности (г/см3) в образце MS представлены в таблице 3.
Таблица 3 – Результаты определения плотности ?20 (г/см3) в образце MS
№ пикнометра, показатель Образец № 1 Образец № 2
Масса пикнометра, г 11,3376 10,4064
Масса пикнометра с субстанцией MS, г 21,3116 20,3825
Плотность ?20 (г/см3) 0,997420 0,997620
Среднеарифметическое значение результатов двух определений с удовлетворением требования предъявляемым к сходимости результатов
0,997520
Плотность ?20 (г/см3) вычисляли по формуле (1):
?20 , (1)
где m – масса пикнометра, г;
m1 – масса пикнометра с MS, г;
Плотность в испытуемом образце составляет 0,9975 г/см3( при 20 °С).
1.2.5 Определение кинематической и динамической вязкостей
Вязкость MS определяли, используя вискозиметр, в соответствии с Европейской Фармакопеей 7,0, п. 2.2.9. Вискозиметр капиллярный стеклянный типа ВПЖ-1 с техническими характеристиками:
1) Диаметр капилляра, мм 0,86
2) Постоянная вискозиметра k, мм2/с2 0,03337
Испытуемую жидкость заливали в чистый вискозиметр так, что уровень её установился между отметками М3 и М4. При температуре опыта (21 °С) вискозиметр выдерживали около 15 мин, после чего всасывали жидкость грушей при закрытой трубке 5 выше метки М1 примерно до середины верхнего расширения.
Кинематическую вязкость (мм2/с) определяли по формуле (2):
v = k·t (2)
по среднему времени истечения жидкости в трех определениях.
t1 = 31,0 c; t2 = 31,2 c; t3 = 31,0 с
Среднеарифметическое значение результатов трёх определений времени истечения жидкости с удовлетворением требования, предъявляемым к сходимости результатов составило 31,0 с.
v = 0,03337 мм2/с2 • 31,0 с = 1,0345 мм2/с
Динамическую вязкость ? (п. 2.2.8) , выраженную в мили-паскаль секундах (мПа•с) вычисляли по формуле (3):
? = k·?·t, (3)
где ? – плотность испытуемой жидкости (мг/мм3).
? = 0,03337 мм2/с2 • 31,0 с • 0,9975 мг/мм3 = 1,03 мПа• с.
Вязкость образца MS составила 1,03 мПа • с (при 21 °С).
1.2.6 Определение показателя преломления
Рефрактометрию применяют для установления подлинности и чистоты вещества.
Определение показателя преломления для образца MS проводили в помещении, предварительно охлажденном до температуры 20 °С. Показатель преломления в данных условиях составил n20D = 1,3340.
Показатель преломления MS определяли согласно ГФ XIII, т. 1, ОФС.1.2.1.2.0017.15 «Рефрактометрия».
1.2.7 Определение сухого остатка и общей золы
В предварительно высушенный до постоянной массы тигель помещали MS около 10,00 г (точная навеска). Упаривали при температуре 100 °С в сушильном шкафу в течение 1 ч, определяли массу сухого остатка, затем сжигали в муфельной печи, нагретой до температуры 600-650 °С, до постоянной массы. Результаты двух параллельных определений массовой доли сухого остатка (Х1, %) и массовой доли общей золы (Х2, %) в образце субстанции MS представлены в таблице 4.
Таблица 4 – Результаты определения массовой доли общей золы (%) в образце MS
№ тигля, показатель Образец № 1 Образец № 2
Масса тигля, г 47,0330 51,9000
Масса тигля с субстанцией MS до упаривания, г 57,0066 61,9420
Масса тигля с сухим остатком, г 47,0604 51,9277
Массовая доля сухого остатка Х1, (%) 0,275 0,276
Масса тигля с золой, г 47,0340 51,9011
Массовая доля общей золы Х2, (%) 3,6 4,0
Массовую долю сухого остатка Х1 в (%) вычисляли по формуле (4):
X1= (4)
Массовую долю общей золы Х2 в (%), вычисляли по формуле (5):
X2= %, (5)
где m – масса тигля, г;
m1– масса тигля с золой, г;
m2 – масса тигля с MS до упаривания, г;
m3 – масса тигля с сухим остатком, г;
100 – коэффициент пересчета в % массовой доли золы в сухом веществе.
1) Массовая доля сухого остатка (в %) в испытуемом образце составила 0,28 %.
2) Массовая доля общей золы (в %) в испытуемом образце составила 3,8 % от сухого вещества.
Золу общую в MS определяли согласно ГФ XIII, т. 1, ОФС.1.2.2.2.0013.15 «Зола общая».
1.2.8 Определение примесей тяжелых металлов
Испытуемый раствор. В предварительно высушенный до постоянной массы тигель помещали MS около 12,00 г (точная навеска). Упаривали при температуре
100 °С в сушильном шкафу в течение 2 ч, охлаждали в эксикаторе и определяли массу сухого остатка. Добавляли 0,5 г магния оксида, тщательно перемешивали и сжигали в муфельной печи, нагретой до 600-650 °С, до образования однородного остатка белого или серовато-белого цвета. Производили двукратное сжигание по 30 мин.
Остаток из тигля количественно переносили в пробирку двумя порциями по 5 мл смеси хлористоводородная кислота - вода в соотношении 1:1. Прибавляли 0,1 мл раствора фенолфталеина, подщелачивали концентрированным раствором аммиака до появления розовой окраски. Подкисляли уксусной кислотой ледяной до обесцвечивания раствора и прибавляли еще 0,5 мл уксусной кислоты ледяной. Доводили объем раствора водой до 20 мл.
Эталонный (стандартный) раствор. Готовили так же, как испытуемый раствор, используя вместо MS 12 мл свинца эталонного раствора (10 ppm Pb). К 10 мл полученного раствора прибавляли 2 мл испытуемого раствора.
Контрольный раствор. Готовили так же, как испытуемый раствор, прибавляя к 2 мл MS 10 мл свинца эталонного раствора (10 ppm Pb). К 10 мл полученного раствора прибавляют 2 мл испытуемого раствора.
Раствор сравнения. Смешивали 10 мл воды и 2 мл испытуемого раствора.
К каждому раствору прибавляли 2 мл буферного раствора рН 3,5 и перемешивали. К полученной смеси прибавляли по 0,1 мл 2 % раствора натрия сульфида, перемешивали и через
1 мин наблюдали окраску растворов.
После проведения реакции интенсивность окраски испытуемого раствора сравнивали с окраской эталонного раствора. Окраска, появившаяся в испытуемом растворе, не должна превышать окраску эталонного раствора.
Определение считается достоверным, если в эталонном растворе наблюдается слабое коричневое окрашивание по сравнению с раствором сравнения.
Полученные данные для испытуемого, эталонного и контрольного растворов по определению содержания примесей тяжелых металлов в образце MS представлены таблице 5.
Таблица 5 – Получение испытуемого, эталонного и контрольного растворов для определения содержания примесей тяжелых металлов в образце MS
№ тигля, (Наименование раствора) 1 (Испытуемый раствор) 2 (Эталонный раствор) 3 (Контрольный раствор)
Масса пустого тигля, г 77,1104 74,4131 47,0344
Масса тигля с раствором до упаривания, г 88,9625 86,1701 58,7803
Масса тигля с сухим остатком, г 77,1416 74,4132 47,0423
Масса тигля с сухим остатком и добавкой MgO, г 77,6453 74,9142 47,5435
Масса тигля с остатком после сжигания, г 77,5902 74,8872 47,5115
После добавления к полученным растворам 2 % раствора сульфида натрия эталонный и контрольный растворы приобрели светло-коричневое окрашивание, с более слабым окрашиванием в контрольном растворе. Испытуемый раствор и раствор сравнения остались без изменения.
Испытуемый образец MS соответствует требованию на содержание примесей тяжелых металлов.
Тяжелые металлы в MS определяли согласно п. 2.4.8, метод D, Европейской Фармакопеи 7.0.
1.2.9 Определение подлинности
1.2.9.1 Определение подлинности на основании физико-химических свойств
При смешивании MS с равным количеством спирта этилового 96 % раствор приобретает зеленовато-серую окраску опалесцирующую розовым цветом. При облучении ярким светом розовая опалесценция усиливается.
При смешивании MS с равным количеством метанола раствор также приобретает зеленовато-серую окраску с розовой опалесценцией. После встряхивания на дне сосуда появляются белые сгустки, которые при перемешивании не растворяются.
При смешивании MS с равным количеством ацетонитрила раствор приобретает серую окраску со слабым зеленоватым оттенком. Опалесценция практически не наблюдается.
При добавлении к 1 мл MS 1 капли 20 % раствора натрия гидроксида наблюдается исчезновение синей окраски и появление светло-зеленой окраски. Опалесценция при освещении практически отсутствует. Через 2 ч раствор окрашивается в бледно-розовый цвет.
1.2.9.2 Определение подлинности по спектру в УФ и видимой областях
Одним из методов, использующихся для определения подлинности вещества, является спектр поглощения света в ультрафиолетовой и видимой областях. Он определяется изменениями под действием поглощенного фотона в энергии валентных электронов при электронных переходах, вследствие чего такой спектр получил название электронного. Они измеряются в спектре электромагнитных волн в диапазоне 190-800 нм.
Снятие спектра и интерпретацию результатов проводили в соответствии с ГФ XIII,
т. 1, ОФС.1.2.1.1.0003.15 «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях».
Готовили ряд водных разведений субстанции MS и выбирали наиболее оптимальный в отношении оптической плотности вариант разведения. Для каждого варианта разведения был снят спектр в интервале длин волн от 200 до 800 нм. Разведения и результаты представлены в таблице 6.
Таблица 6 – Выбор условия для снятия спектра
Разведение Фактическое содержание Результат (оптическая плотность) А (AU)
1 : 1 1 часть MS и 1 часть воды очищенной высокая (выше 4,0)
1 : 4 1 часть MS и 4 части воды очищенной от 0,05 до 2,0
1 : 9 1 часть MS и 9 частей воды очищенной от 0,03 до 1,0
1 : 19 1 часть MS и 19 частей воды очищенной от 0,02 до 0,5
Оптимальная оптическая плотность соответствовала разведению 1 : 9.
Раствор для получения электронного спектра в видимой и ультрафиолетовой областях готовили следующим образом. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещали 1,0 мл MS, доводили водой очищенной до метки, перемешивали.
Спектр MS в видимой и ультрафиолетовой областях представлен на рисунке 1, а его характеристика в таблице 7.
Рисунок 1 – Спектр MS
Таблица 7 – Характеристики спектра
№ п/п Максимумы, длина волны, нм Оптическая плотность, AU Минимумы, длина волны, нм Оптическая плотность, AU
1 615,3 0,654 470-472 0,034
2 348,6 0,154 246 0,423
3 268,7 0,519 - -
1.3 Разработка методик контроля качества MS
1.3.1 Разработка методики определения подлинности MS методом ВЭЖХ
Субстанция MS представляет собой природный многокомпонентный субстрат, который представляет собой сложную смесь веществ различной природы. Подлинный состав до сих пор не ясен. На основании многочисленных исследований MS сделано предположение о белковой структуре отдельных молекул. Также метод ЯМР позволил выделить группу сигналов свойственных углеводам, что может свидетельствовать о наличии множества гликозидных элементов. Получены данные о наличии веществ полифенольной структуры. Все вышеперечисленные вещества могут влиять на фармакологический эффект, но самое ценное влияние на организм оказывают, вероятно, пигменты, представляющие собой хромопротеины.
Наличие хромопротеинов, белков, содержащих окрашенные простетические группы, придает MS синюю окраску. Это могут быть хризоламинарин, фикобилины (фикоцианин, фикоэритрин, алофикоцианин) и, возможно, другие пигменты.
