Глава 1. Обзор литературы по теме исследования
1.1. Пушкинская порода кур: характеристика и методы разведения
Пушкинская яично-мясная порода была выведена на основе поглотительного скрещивания австролорпов черно-пестрых с белыми леггорнами в вводных скрещиваниях с московскими белыми и цветными петухами 4-линейных гибридов мясного кросса «Бойлер-6». Порода утверждена в 2007 году с живой массой кур 2,2 кг, петухов 2,7 кг и яйценоскостью 200 яиц за 60 недель жизни с массой 61 г (белая окраска скорлупы) [35]. Птица имеет уникальную окраску покрова. Куры полосато-пестрые с белым подпухом, петухи белые со следами полосатости, кожа ног и подкожного жира белые. Ушные мочки бело-розовые, форма гребня розовидная (82%) и листовидная (18%) [34]. К возрасту 7-9 недель птица приобретает характерную окраску оперенья [14].
Долгое время в породе велась селекция на увеличение живой массы, отразилось на параметрах экстерьера птицы: к 2015 году куры достигли живой массы 2,3 кг, а племенные петухи 3,1 кг. Основным методом разведения является свободно-групповое спаривание – панмиксия, ограниченная отбором и подбором [17, 34]. Пушкинская порода кур обладает универсальным типом продуктивности (яично-мясная) [11], поэтому при разведении учитывается перспективность её использования в приусадебном и фермерском птицеводстве, где популярна птица комбинированной продуктивности [35].
1.2. Маркерная технология и селекция
1.2.1. Генетический полиморфизм и молекулярно-генетические маркеры
Генетический полиморфизм – разная вариация генов (poly – много, morpho – форма) [12]. Область молекулы ДНК, несущая информацию о первичной структуре белка или РНК, называется геном, в то время как полный набор генов в клетке, органелле или вирусе называется геномом. У млекопитающих гены находятся в хромосомах, где их сосредоточено десятки и сотни тысяч [2]. Место, где расположен ген на хромосоме, называется локусом.
Для каждого генетического локуса характерен определенный уровень изменчивости, который заключается в наличие нескольких вариантов генов (аллелей) у разных особей. Различные варианты процессинга могут увеличить число белков в клетке по отношению к числу генов. А изменения в последовательности ДНК (мутации) могут привести к возникновению альтернативных вариантов генов. Если мутация встречается с частотой более 1,5-3% и не приводит к явным фенотипическим проявлениям заболевания, она рассматривается как полиморфизм [5]. Таким образом, наличие в популяции нескольких аллелей одного локуса, называется генетическим полиморфизмом.
Изменения функции при генетическом полиморфизме могут быть [12]:
• Выгодными для организма,
• Нейтральными или слабо отрицательными,
• Отрицательными,
• Выгодными в определенной среде и отрицательными – в другой.
Некоторые из полиморфизмов довольно распространены, другие встречаются редко. Генетический полиморфизм может быть вызван заменой нуклеотидов, дупликацией (удвоение нуклеотидов), инсерцией (вставками нуклеотидов), делециями (выпадение нуклеотидов), инверсией (изменение последовательности нуклеотидов) [12, 63, 66]. Если аллели одного локуса отличаются на один нуклеотид, то такое различие называется однонуклеотидным полиморфизмом [13].
Генетический полиморфизм может быть количественным или качественным. Количественный генетический полиморфизм представлен факультативными элементами, например, варьирующие по числу тандемные повторы (минисателлитная ДНК – 10-100 п.н. и микросателлитная ДНК – не более 10 п.н.) или ретротранспозоны. Качественный генетический полиморфизм представлен преимущественно однонуклеотидными заменами — SNP (Single Nucleotide Polymorphism) [1, 65].
Относительно небольшой геном кур (1200 Мбит/с) содержит около 15% повторяющейся ДНК, представленной в виде коротких тандемных повторов, локализованных, например, в центромерных и теломерных районах хромосом, а также многочисленных семейств чередующихся повторов, полученных в основном из транспозируемых элемнтов (например, транспозонов и ретротранспозонов) [60]. Такие повторы равномерно распределены по всем хромосомам генома.
Полиморфные последовательности ДНК используются в качестве маркеров в генетических и геномных исследованиях [12]. Молекулярно-генетические маркеры (ДНК-маркеры) – это полиморфный признак, обнаруживаемый методами молекулярной биологии на уровне нуклеотидной последовательности ДНК, для конкретного гена или для любой другой части генома при сравнении различных генотипов, особей, пород, сортов, линий [66].
ДНК-маркеры являются третьим поколением генетических маркеров. Им предшествовали белковые маркеры, а еще ранее – классические генетические маркеры.
Классический генетический маркер соответствует гену, аллели которого имеют четко выраженные отличия на уровне фенотипа. Белковый маркер соответствует гену, аллели которого имеют отличия (разную молекулярную массу) на уровне белкового продукта. Молекулярный маркер соответствует гену или некодирующему участку генома, разные варианты (аллели) которого отличаются на уровне ДНК [27]. В целом генетический маркер может быть определен как [29]:
1) Хромосомная метка или аллель, позволяющие проследить специфичный район ДНК;
2) Специфичный фрагмент ДНК с известной позицией в геноме;
3) Ген, чья фенотипическая экспрессия обычно легко отличима и может быть использована для идентификации несущей ее особи или клетки (ткани, органа) либо как зонд для мечения клеточных органелл (ядра, митохондрий, хлоропластов), хромосом или хромосомных локусов.
Эволюция молекулярных маркеров идет в направлении повышения разрешающей способности, быстроты, простоты и, по возможности, снижения стоимости анализа. Исследователями сформулированы требования к ДНК маркерам, согласно которым идеальный молекулярный маркер должен отвечать комплексу характеристик [29]:
• Полиморфным, поскольку «исходным материалом» генетика и селекционера является изменчивость, а полиморфизм – ее отражение или проявление;
• Мультиаллельным, так как благодаря этому увеличивается частота и спектр полиморфности;
• Кодоминантным, потому что в этом случае гетерозиготный гибрид одновременно проявляет свойства обоих родителей, что позволяет различать обе гомозиготы как друг от друга, так и от гетерозиготы;
• Неэпистатичным, поскольку проявление маркера индивидуального генотипа может быть выявлено визуально независимо от месторасположения выбранного маркера в геноме индивидуума (кодоминирование и неэпистатическое проявление признака могут быть определены как отсутствие внутри- и межлокусного взаимодействия, соответственно);
• «Нейтральным», так как замена аллелей в маркерном локусе не имеет фенотипического или селективного эффекта (полиморфизм на молекулярном уровне ДНК почти всегда нейтрален);
• Нечувствительным к воздействию окружающей среды, что должно проявляться в корреляции фенотипа и проявлении маркера или маркерного признака вне зависимости от воздействия окружающей среды.
Наличие нескольких типов маркеров объясняется тем, что ни один из них с высокой степенью не соответствует всей сумме перечисленных критериев. При этом очевидно, что особенности той или иной разновидности молекулярных маркеров обуславливают их более успешное применение для решения тех или иных задач.
Исследователи перед началом эксперимента должны определить, какой тип маркеров использовать исходя из следующих критериев: вариабельность и количество требуемых маркеров, необходимость в их кодоминантности, соответствующие требования к растительному материалу и выделяемой ДНК, размер генома и плоидность таксона; практические – эффективность анализа, стоимость и соответствующее техническое обеспечение. Более того, тенденцией современных исследований с привлечением молекулярных маркеров является использование двух и более типов маркеров, что приводит к более однозначным, достоверным результатам [41].
Молекулярные маркеры подразделяют на монолокусные и мультилокусные. Монолокусные маркеры наследуются чаще всего по кодоминантному типу, мультилокусные – по доминантному [27].
Помимо этого, их разделяют на три группы, согласно основному методу анализа: маркеры, исследуемые с помощью блот-гибридизации, ПЦР и ДНК-чипов (рис. 1).
Данная классификация отражает процесс «эволюции» ДНК-маркеров. Первая из трех перечисленных выше групп представляет собой первое поколение ДНК-маркеров, получивших широкое распространение в 1980-е годы. В 1990-е годы ключевые позиции заняли ПЦР-маркеры, в 2000-е годы их существенно потеснили молекулярные маркеры, основанные на использовании ДНК-чипов. В последние годы для анализа полиморфизма ДНК все чаще используют метод прямого секвенирования генома или его отдельных участков [27].
Развитие метода ПЦР со случайными праймерами привело к разработке новых типов ДНК-маркеров, основанных на использовании длинных концевых последовательностей (LTR – long terminal repeat) ретротранспозонов. Большое количество копий и широкое распространение ретротранспозонов в геномах эукариот делают ДНК-маркерные системы, разработанные на их основе, весьма перспективными. К маркерным системам на основе последовательностей ретратранспозонов относят IRAP, REMAP, RBIP и iPBS [32].
Рисунок 1. Схематическая классификация некоторых молекулярных маркеров и год их первого упоминания в публикациях [27]
Основные классы молекулярных маркеров:
AFLP (amplified fragment length polymorphism) – полиморфизм длины амплифицированных фрагментов. Являются доминантными диаллельными маркерами. Можно оценивать изменчивость одновременно по многим локусам и выявлять единичные нуклеотидные замены в неизвестных участках генома, в которых может присутствовать неизвестный функциональный ген, несущий данную мутацию.
AFLP-анализ осуществляется в три этапа [7]:
• Рестрикция геномной ДНК двумя рестриктазами (Eco RI и Mse I) с образованием фрагментов с выступающими 3'-концами;
• Лигирование (сшивание молекул ДНК посредством ферментов ДНК-лигаз) продуктов рестрикции (геномной ДНК) с адаптером;
• Две последовательные полимеразные цепные реакции (ПЦР) полученных фрагментов с использованием праймеров.
В первой ПЦР (преамплификация) используются праймеры, полностью комплементарные адаптерам Eco RI и Mse I. В результате образуется большое количество продуктов амплификации между адаптерами Eco RI и Mse I, которые невозможно дифференцировать с помощью электрофореза. Поэтому во второй ПЦР праймеры с адаптерами Eco RI и Mse I содержат на 3'-конце дополнительные и некомплементарные адаптерам основания (от 1 до 3) для селективной амплификации. Разделение фрагментов ДНК выполняется в полиакриламидном геле с радиоактивной или флуоресцентной меткой [6].
Маркеры AFLP часто используются для широкого спектра исследований: картирование всего генома, оценка генетического разнообразия популяции, исследования гибридизации и интрогрессии, филогенетический анализ и определение селекционного влияния. AFLP-маркеры имеют достаточно низкую стоимость в сравнении с другими маркерами. Однако их использование в качестве маркеров, тесно связанных с конкретными признаками, может представлять ряд ограничений, поскольку только небольшой процент таких маркеров локализован в непосредственной близости с генами, представляющими интерес [37].
CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences) – расщепленные амплифицированные полиморфные последовательности. CAPS-маркеры представляют собой обособленную группу хорошо изученных и успешно применяемых маркеров.
Прицип работы CAPS-маркеров достаточно прост и основан как минимум на трех последовательных этапах:
• Проведение ПЦР со специфическими праймерами;
• Гидролиз фрагментов амплификации (ампликонов) с помощью эндонуклеаз рестрикции;
• Последующее разделением продуктов гидролиза в агарозном геле.
Принцип действия CAPS-маркеров сочетает в себе широко используемый метод ПЦР с классическим методом RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism, полиморфизм длины рестрикционного фрагмента,), только основан он на амплификации небольшого фрагмента ДНК вместо использования всего генома.
Основная особенность создания и использования CAPS-маркеров заключается в том, что генетические изменения в нуклеотидной последовательности должны затрагивать сайты распознавания эндонуклеаз. В самом простом случае, образец амплификации обладающий сайтом рестрикции, после обработки специфической эндонуклеазой будет представлен двумя фрагментами, в то время как полиморфный образец с измененным сайтом распознавания эндонуклеазы после такой же обработки будет представлен единственным фрагментом. Суть CAPS-маркеров заключается именно в обнаружении таких измененных сайтов рестрикции на ампликоне [31].
DArT (diversity array technology) – ДНК-чип технология для изучения разнообразия. DArT-технология основывается на выявлении полиморфных ДНК фрагментов. Подготовка DArT-чипа происходит следующим образом:
• Выделение и подготовка ДНК пробы путем рестрикции ДНК и лигирования;
• Разделение полученного материала на неполиморфные и полиморфные фрагменты;
• Отбор полиморфных фрагментов посредством их клонирования и трансформации в E. coli;
• Амплификация полиморфных фрагментов, отобранных для создания генной библиотеки, с последующей окраской синим флуорофором и нанесением на стеклянные диски, в результате чего образуется DArT-чип.
На основании этих чипов осуществляют гибридизацию с подготовленными «ДНК-мишенями» путем геномной репрезентации и меченными зеленым флуорофором. Далее идет сканирование чипов и измерение интенсивности флуоресцентного свечения для каждого маркера [7].
IPBS — (inter PBS amplification), метод, основанный на использовании праймеров к PBS (Primer Binding Site, участок связывания тРНК) последовательностям ретротранспозонов. PBS представляют собой консервативные области, которые обнаруживаются в последовательностях LTR ретротранспозонов. Технология IPBS обладает заметным преимуществом в сравнении с другими методами анализа ретротранспозонов, поскольку для использования маркеров-IPBS не нужно предварительно знать последовательность нуклеотидов в интересующих областях генома [36].
IRAP (inter-retrotransposon amplified polуmorphism) – полиморфизм амплифицированных последовательностей между ретротранспозонами. Полимеразная цепная реакция между праймерами, комплементарными последовательностям двух рядом расположенных LTR ретротранспозона. Метод имеет несколько вариантов. В первом варианте IRAP используется единичный праймер из LTR. Продукты амплификации образуются между двумя инвертированными LTR с одинаковой последовательностью, то есть в одной цепи 5’-конец одного LTR ориентирован к 3’-концу другого LTR. Если центральная часть ретротрапозона длинее обычного размера ПЦР продуктов (около 3000 пар оснований), то ПЦР будет проходить только между двумя LTR из разных ретротранспозиций. В этом случае соседние LTR должны располагаться в инвертирванном положении. В другом варианте IRAP используются два разных праймера к ивертированным LTR: один праймер с 5’-конца, а другой с 3’-конца LTR, ориентированые в разные стороны от ретротранспозона. В данном случае соседние LTR располагаются как прямые длинные повторы. И, наконец, в третьем варианте IRAP используются праймеры к LTR из разных ретротрапозонов в различной ориентации. Можно комбинировать праймеры из LTR с другими праймерами из повторяющейся ДНК [66].
ISSR (inter simple sequence repeats) – межмикросателлитные последовательности. Метод основан на амплификации областей ДНК, расположенных между двумя идентичными, но противоположно ориентированными участками микросателлитных повторов. Размер промежуточной нуклеотидной последовательности ДНК между микросателлитами должен быть в пределах диапазона размеров, который практически позволяет проводить успешную ПЦР-амплификацию. Праймеры, используемые в этом методе, также являются микросателлитами, и могут представлять собой ди-, три-, тетра- или пентануклеотидные повторы. Обычно в этом методе используются длинные праймеры размером 15–30 оснований [36]. Десятки фрагментов множества локусов, полученных в ПЦР, разделяются электрофорезом и оцениваются на присутствие или отсутствие (вследствие доминантности маркеров) фрагментов определенного размера. Основное преимущество ISSR заключается в том, что для конструирования праймеров не требуется никаких предварительных знаний о последовательности ДНК. Кроме того, применение ПЦР позволяет использовать лишь небольшое количество ДНК в аналитических процедурах ISSR. Обычно для каждой реакции достаточно 10–50 нг ДНК хорошего качества. Следует учитывать, что вследствие мультилокусности возможна гомоплазия. Маркеры данного типа используются для выявления генетической идентичности, родословной, дифференциации клонов, микроклонов и линий, таксономии близкородственных видов [16].
RAPD (random amplified polymorphic DNA) – случайно амплифицированная полиморфная ДНК; вариант классической полимеразной цепной реакции со случайной амплификацией неизвестного, анонимного, участка генома. Метод позволяет выявлять полиморфизм ДНК по наличию или отсутствию фрагментов разного размера или длины пар оснований, которые образуются в результате обработки ДНК специфическими эндонуклеазами рестрикции [36]. Затравкой для синтеза ПЦР-фрагментов на ДНК-матрице является один короткий праймер (длиной менее 10 пар нуклеотидов) с низкой температурой отжига (около 40°C), что в процессе ПЦР приводит к образованию множества фрагментов, длина которых зависит от распределения вдоль ДНК места посадки праймеров, расположенных напротив друг друга [20].
RBIP (retrotransposon-based insertion polymorphisms) — использование праймеров к последовательностям ретротранспозонов и выявляющий кодоминантные аллельные варианты. Принцип основан на мультилокусной ПЦР, в которой используются пара праймеров, фланкирующих участок ДНК до ретротранспозиции и праймер к LTR ретротранспозона, который встроен в данный участок между первыми двумя праймерами. В результате ПЦР будет амлифицироваться один из вариантов фрагментов, фланкированных парой праймеров, поскольку последовательность между LTR слишком длинная для ПЦР между сайтами геномной ДНК с ретротранспозоном внутри; выявляет полиморфизм только для данного полиморфного локуса.
REMAP — (retrotransposone microsatellite amplified polymorphism), полимеразная цепная реакция между праймером к фрагменту LTR ретротранспозона и праймером из рядом расположенного, простого микросателлитного повтора (ISSR праймер). В данном случае позиция амплифицируемого фрагмента ретротранспозона «заякоривается» путём использования праймера к микросателлитному локусу [66].
RFLP (restriction fragment length polymorphism) – полиморфизм длины рестрикционных фрагментов.
Принцип работы основан на детекции специфических нуклеотидных последовательностей в геномной ДНК, расщепленной эндонуклеазами рестрикции, с помощью «блот-гибридизации». В основе возникновения RFLP лежат вариации в последовательности ДНК. Вследствие точковых мутаций, делеций, инсерций, инверсий, транслокаций могут появляться и исчезать сайты узнавания рестриктаз, меняться расстояния между сайтами, что приводит к изменению набора рестрикционных фрагментов.
RFLP-анализ проходит следующим образом [7]:
• Выделение ДНК из ткани исследуемого материала;
• Рестрикция ДНК;
• Электрофоретическая детекция и разделение продуктов рестрикции;
• Метод Блоттинга по Саузерну – нанесение полученных участков ДНК на мембраны с последующей гибридизацией с меченым зондом;
• Анализирование по положению на радиоавтографах.
SCAR (sequence characterized amplified region) – амплифицированная область, охарактеризованная нуклеотидной последовательностью. Развитие и использование данных маркеров экспоненциально растет с начала 1990-х годов. SCAR представляет собой улучшенный вариант RAPD. Модификация и преобразование RAPD-маркера в кодоминантный, более локус-специфичный и воспроизводимый маркер SCAR, повышает надежность анализа. SCAR представляет собой метод, в основе которого лежит ПЦР. Он позволяет идентифицировать фрагмент геномной ДНК в одном локусе с использованием пары специфических олигонуклеотидных праймеров размером 15–30 п.н. Такие праймеры созданы из нуклеотидных последовательностей, полученных с помощью амплифицированных полиморфных фрагментов RAPD. Технология SCAR технически проста и легко выполнима, однако основным ограничением является то, что для разработки праймеров необходимо предварительно владеть информацией о последовательности полиморфного фрагмента RAPD. Очевидно, что это требование представляет препятствие для использования SCAR [36].
Тем не менее, разработанные специфические SCAR маркеры позволяют успешно дискриминировать определенные молекулярные фенотипы различных видов одного рода, используемые в таксономии дискриминирование экотипов, выявление уникальных сомаклональных вариантов и молекулярных событий, сопряженных с вариабельностью сомаклонов [16].
SNP (single-nucleotide polymorphism) – однонуклеотидный полиморфизм; маркеры данного типа становятся все более используемыми в исследованиях генома. SNP представляют собой генетические полиморфизмы, которые возникают из-за различий в одну пару нуклеотидов в последовательностях ДНК среди особей одного вида или разных видов. По сравнению с другими генетическими маркерами SNP представляют собой наиболее часто встречающуюся форму полиморфизма ДНК в организмах [51]. SNP с разной степенью встречаемости расположены в кодирующих, некодирующих, а также межгенных областях генома с примерной частотой один SNP на каждые 100–300 п.н. ДНК [36]. Локализация SNP в экспрессирующиеся последовательности или области, влияющие на экспрессию генов, могут вызывать изменения в структуре белка или регуляции. Такие SNP предоставляют определенные возможности для выявления функциональных генетических вариантов. Поскольку метод позволяет автоматизированно осуществлять высокоразрешающее генотипирование с одновременным использованием большого количества SNP маркеров; присутствие многих тысяч проб на чипе позволяет одновременно анализировать множество SNPs. Но в то же время различие аллелей только по одному нуклеотиду и множество проб делает невозможным создание оптимальных условий гибридизации для всего массива проб [16, 21].
SSAP (sequence-specific amplified polymorphism) – полиморфизм сиквенс-специфичной амплификации. Является производным AFLP, амплифицируя продукты между местом интеграции РТ и местом рестрикции, к которому «привязан» адаптер [16]. Показано, что метод SSAP имеет ряд преимуществ по сравнению с другими маркерными системами: он позволяет получить большое количество полиморфных фрагментов и проводить дифференцировку большинства образцов, используя только одну комбинацию специфических праймеров [52].
SSCP (single strand conformation polуmor phism) – полиморфизм конформации одноцепочечной ДНК. Особенно эффективны для поиска однонуклеотидных замен в ДНК. Процесс работы заключается в том, что после проведения ПЦР, продукт амплификации денатурируют и полученные однонитевые молекулы разделяют с помощью электрофореза полиакриламидном геле. Такой подход дает возможность выявлять нуклеотидные замены, делеции, инсерции на протяжение всей длинны амплифицированного продукта, а не только в местах узнавания рестриктаз, и добиваться большей информативности [22].
SSR (simple sequence repeats) – простые повторяющиеся последовательности (микросателлиты). Микросателлиты, или SSR (Simple Sequence Repeats), или STR (Simple Tandem Repeats) представляют собой простые последовательности, которые образуют тандемные повторы мононуклеотидных, динуклеотидных, тринуклеотидных, тетрануклеотидных, пентануклеотидных и гексануклеотидных участков (например, CACACACACACACACA), которые широко распространены, полиморфны и беспорядочно распределены по геному многих видов. Наиболее часто встречающиеся участки представляют собой моно-, ди-, три- и тетрануклеотиды [21, 36]. Естественными причинами разнообразия в количестве повторов единиц микросателлитов в геноме являются «проскальзывание» (slippage) полимеразы в ходе репликации ДНК, и/или несоответствующий кроссинговер, несовпадение/восcтановление повреждений двойной нити ДНК, а также перемещения ретротранспозонов. Эти вариации приводят к полиморфизму по длине фрагментов, выявляемых при электрофорезе [16].
STS (sequence tagged site) – сайт/локус, маркированный нуклеотидной последовательностью. Маркер STS представляет собой короткую последовательность ДНК, которая встречается в геноме только один раз. Расположение и последовательность оснований в данном случае предварительно известны. Маркеры STS можно легко обнаружить с помощью специфических праймеров [50]. Они не всегда бывают полиморфными и используются для построения физической карты генома [21].
VNTR (variable number tandem repeat) — участок ДНК, содержащий различное число коротких тандемно повторяющихся нуклеотидных последовательностей; после расщепления таких участков рестриктазами образуются рестрикционные фрагменты различной длины, которые могут быть эффективно использованы в качестве маркеров при картирование генов; в этот локус часто входят микросателлиты.
