1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1 Характеристика дрожжевой клетки
Дрожжи – это простейшие одноклеточные эукариотические микроорганизмы. Эти организмы обладают всеми основными свойствами одноклеточных грибов. Дрожжевая клетка (см. рис. 1.1) имеет сочетание признаков как растительной, так и животной клеток: клеточная стенка у них ригидная, как у растений, но в клетке отсутствуют хлоропласты и накапливается гликоген, как у животных.
Такие структуры, как ядро с двойной мембраной, митохондрии, эндоплазматический ретикулум и его производные, обнаруживаются в клетках всех дрожжей во все периоды клеточного цикла. Но в целом очень существенные различия наблюдаются в ультраструктурной организации и поведении отдельных органелл в зависимости от возраста клетки, внешних условий, стадии онтогенеза. Следует также отметить, что большинство сведений по цитологии дрожжей получено при изучении клеток Saccharomyces cerevisiae и некоторых других видов аскомицетовых дрожжей. У других видов детали цитологического строения могут несколько отличаться [1].
Ядро регулирует и направляет химические процессы в клетке и образует с цитоплазмой единую взаимосвязанную систему. Ядро клетки содержит основное вещество (плазму), матрицу ядра и хромосомы. В них каждая клетка хранит свой структурный план, закодированный в форме генов. Гены построены из полимерной молекулы, дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), информационный объем которой составляет 109-1010 бит. ДНК управляет всеми процессами обмена веществ, роста и развития клетки. В ядре клетки размещено также ядрышко (nucleolus), которое состоит из рибонуклеиновой кислоты [2].
Митохондрии представляют собой разной формы органеллы, которые окружены двойной мембраной. Эти мембраны не похожи. Внутренняя мембрана образует кристы, с которыми связаны ферменты окислительного фосфорилирования. В матриксе митохондрий находятся ферменты цикла трикарбоновых кислот. Основная функция митохондрий - синтез АТФ в процессе дыхания.
В митохондриях имеется собственная митохондриальная ДНК (мДНК), а также весь аппарат белкового синтеза, включая матричную РНК и 70S рибосомы (в отличие от 80S рибосом в цитоплазме). мДНК у дрожжей составляет 5-20 % от всей ДНК клетки и кодирует некоторые ферменты митохондриального матрикса, например, цитохром-соксидазу, комплекс АТФ-азы, ферменты процессинга РНК, а также субъединицы митохондриальных рибосом. Другие ферменты митохондриального матрикса импортируются в него из цитоплазмы и кодируются ядерной ДНК. Клетки, которые утеряли вследствие мутаций часть или всю мДНК (так называемые petite-мутанты), образуют на плотных средах очень мелкие (petite) колонии, так как их рост происходит только за счет гликолиза, но не дыхания.
Число митохондрий в одной дрожжевой клетке варьирует в пределах 1-20 в разные периоды роста и в зависимости от условий. Как правило, 1-2 митохондрии в клетке более крупные, чем остальные и имеют разветвленную форму. Реконструкция ультратонких срезов клетки позволяет предположить, что в некоторых случаях (в подготовительный период почкования) клетка содержит всего одну вытянутую и сильно разветвленную митохондрию. Митохондрии способны к самовоспроизведению и никогда не образуются de novo [3].
Клеточная мембрана, или плазмолемма, которая окружает дрожжевую клетку, играет роль барьера проницаемости и отслеживает транспорт веществ в клетку и из нее. Кроме того, в состав мембраны входят ферменты, которые участвуют в биосинтезе клеточной стенки.
На поперечном срезе под электронным микроскопом мембрана у дрожжей выглядит как трехслойная структура. Она представляет собой два слоя фосфолипидов, в которые погружены белковые молекулы, то есть построена по общему принципу всех клеточных мембран. Однако имеются различия, которые касаются химического состава.
У Saccharomyces cerevisiae основными фосфолипидами мембран являются фосфатидилхолин (лецитин), фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин. На их долю приходится около 90 % всех липидов мембраны. В состав мембраны дрожжей входят также липиды стероидной природы – эргостерол, зимостерол и др. В основном белки представлены ферментами, которые участвуют в переносе трансмембранных веществ, распаде полисахаридов, образовании внеклеточной структуры.
Функции цитоплазматической мембраны многообразны: регуляция биосинтеза клеточной стенки, транспорт в клетку специфических молекул органических веществ, ионов K+ и Na+ и др.
Эндоплазматический ретикулум и комплекс Гольджи. Система внутриклеточных мембран, которые разделяют внутреннее пространство клетки на отсеки, носит название эндоплазматического ретикулума (ЭПР). Часть этих мембран имеет гладкую поверхность (гладкий ЭПР), другие покрыты рибосомами (шероховатый ЭПР). ЭПР принимает участие в синтезе макромолекул (гликогена, белков) и во многих других клеточных процессах. Из мембран ЭПР образуются пузырьки - везикулы, которые содержат ферменты, доставляемые в разные отделы клетки, например, к месту роста почки. Через ЭПР осуществляется связь между плазмолеммой и мембранами митохондрий.
В мембранной системе дрожжевой клетки можно выявить параллельно расположенные стопки (диски) мембран – диктиосомы – с функцией аппарата Гольджи. По периферии диски расширяются в виде валика и окружены пузырьками или звездчатыми фагосомами. Они выполняют экскреторные и секреторные функции, участвуют в образовании новых мембран и формировании стенок растущих клеток. Аппарат Гольджи – источник формирования особых везикулярных структур – лизосом. Это мембранные пузырьки – очень мелкие вакуоли с гидролитическими ферментами, которые участвуют в освобождении клетки от чужеродных и собственных необратимо поврежденных субклеточных компонентов. При их разрушении освобождающиеся ферменты могут привести к полному лизису всей клетки, за что они и получили образное название – «мешки самоубийцы».
В клетке часто можно найти наполненные кислой клеточной жидкостью и пространства, окруженные мембраной – вакуоли. Здесь откладываются определенные протеины и избыточные соли. С помощью обратимой мобилизации кристаллов солей клетка может регулировать ее внутреннее давление (тургор), если, например, осмотическое давление снаружи увеличится благодаря повышенному содержанию экстракта или спирта. Зрелые дрожжевые клетки содержат большую вакуоль. Считают, что при образовании почки вакуоль дробится на мелкие вакуоли, которые распределяются между материнской клеткой и почкой. В дальнейшем эти мелкие вакуоли снова сливаются, образуя по одной вакуоли в материнской и дочерней клетках. Функция вакуоли точно не установлена. В ней содержатся гидролитические ферменты, полифосфаты, липиды, ионы металлов и др [1]. Характерной особенностью вакуолей дрожжей является наличие в них метахроматина (волютина). Он может накапливаться в больших количествах как запасное вещество, при голодании запас его быстро уменьшается, как это происходит с жиром и гликогеном [4].
Клеточная стенка. Дрожжевые клетки окружены ригидной структурой – клеточной стенкой, которая защищает протопласт от осмотического разрыва и придает клетке определенную форму. Она составляет от 10 до 30 % сухой биомассы дрожжей. При длительном замедленном росте ее доля увеличивается, при быстром – уменьшается. Клеточная стенка дрожжей состоит в основном из полисахаридов с небольшим включением других веществ – белков, липидов. В гидролизатах клеточных стенок аскомицетовых дрожжей доминируют три моносахарида: D-глюкоза, D-манноза и N-ацетил-D-глюкозамин, из которых и построены основные полимеры клеточной стенки - ??глюкан, ?-маннан и хитин. В гидролизатах разных дрожжей встречаются и другие моносахариды: D-галактоза и D-глюкозамин у аскомицетовых дрожжей, L-фукоза и L-ксилоза – у базидиомицетовых. Хитин аккумулируется в основном в почечных рубцах.
Детальная картина организации клеточной стенки всего разнообразия дрожжей еще не совсем ясна. Наиболее полно изучено строение клеточной стенки у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Основной структурный компонент клеточной стенки, ответственный за ее ригидность – полисахарид ?-глюкан. Он образует микрофибриллярную сеть непосредственно вокруг цитоплазматической мембраны. Структурные маннопротеиды в комплексе с белками образуют аморфный внешний слой. Эти два слоя разделены промежуточным слоем с повышенным содержанием белков. Маннановые цепи обычно прикреплены к остаткам аспарагина или серина в белке. Маннан может использоваться клеткой в качестве резервного источника углерода, поэтому его содержание значительно колеблется в зависимости от условий роста.
На срезах клеток в электронном микроскопе клеточная стенка аскомицетовых дрожжей имеет внутренний светлый слой и внешний, более тонкий темный электронно-плотный слой, соответствующие глюкановому и маннановому каркасам. У базидиомицетовых дрожжей, клеточная стенка состоит главным образом из разного типа глюканов, и на срезе видна тонколамеллярная структура без чередования темных и светлых. Этот признак имеет таксономическое значение при определении аффинитета у несовершенных дрожжей.
Глюкан клеточной стенки аскомицетовых дрожжей растворяется под действием клеточного сока виноградной улитки. Гепатопанкреатический секрет улитки содержит более 30 различных ферментов и давно используется в исследованиях для разрушения клеточных стенок дрожжей и получения протопластов. У базидиомицетовых дрожжей протопластов при такой обработке не образуется.
Капсула. Клетки многих видов дрожжей образуют капсулу – слизистый полисахаридный чехол вокруг клетки. Капсула прозрачна и увидеть ее в световой микроскоп можно только после окраски препарата методом негативного контрастирования. Для этого препараты из культур дрожжей готовят в растворе туши или другой мелкодисперсной взвеси. Мелкие частицы не проникают в плотную капсулу и они видны в виде светлых ореолов вокруг клеток на темном фоне. При подготовке препаратов к электронной микроскопии капсулы высыхают и превращаются в отдельные тяжи. Способность к образованию капсул особенно характерна для тех дрожжей, которые обитают на твердых поверхностях - на листьях растений, в почве. Этот слой может быть очень тонким (микрокапсула), но иногда его толщина превышает диаметр клетки в 2-3 раза. Размеры капсулы зависят от вида дрожжей и условий среды обитания.
Состав внеклеточных капсульных полисахаридов варьирует в зависимости от вида дрожжей. Соединения, образующие капсулу, могут относиться к следующим группам.
1. Фосфоманнаны – синтезируются некоторыми аскомицетовыми дрожжами рода Pichia и образуют тонкий слой на поверхности клеточной стенки. Эти соединения представляют собой олигосахаридные цепочки ??(1?3) маннозы, соединенные между собой фосфоэфирными связями.
2. ?-Глюканы, к числу которых относится пуллулан, образуемый дрожжеподобным грибом Aureobasidium pullulans. Он представляет собой полимер, в котором мальтотриозные блоки связаны между собой ??(1?6) гликозидной связью.
3. ?-Маннаны – образуются пигментированными дрожжами из родов Rhodotorula, Sporobolomyces. Они представляют собой линейные полимеры маннозы с чередующимися ??(1?3) и ??(1?4) связями.
4. Гетерополисахариды – характерны для многих несовершенных дрожжей базидиомицетового аффинитета из рода Cryptococcus, а также аскоспоровых дрожжей Lipomyces. Гетерополисахариды криптококков и липомицетов очень разнообразны по составу и строению. Обычно они имеют разветвленную структуру и могут состоять из остатков глюкуроновой кислоты, галактозы, глюкозы, маннозы, ксилозы, фукозы. У некоторых видов в основную цепь капсульных полисахаридов входят уроновые кислоты.
Функции капсулы многообразны. Капсулы способствуют прикреплению клеток к поверхности твердого субстрата, создают особую межклеточную среду, способствуют улучшению водного снабжения клетки.
Цитоплазма. Основное вещество цитоплазмы составляет так называемый матрикс, в котором расположены все органеллы клетки. Матрикс содержит большое количество рибосом, полифосфатов, запасные углеводы – гликоген и трегалозу, многие ферменты и циклическую ДНК. Рибосомальная РНК составляет более 85 % от общей суммы рибонуклеиновых кислот, содержание которых в 50-100 раз превышает концентрацию ДНК и достигает 12 % от сухой массы дрожжевых клеток.
В цитоплазматическом матриксе, примыкающем к плазмолемме обнаруживаются сильно полимеризованные полифосфаты в виде гранул волютина. Это резерв энергетического материала, используемого в различных процессах метаболизма.
В дрожжевой клетке содержится 24-40 % углеводов в пересчете на сухое вещество. Они состоят в основном из гликогена, который вместе с трегалозой представляет собой запасные вещества. Гликоген – запасное питательное вещество в дрожжах, характеризующее их хорошее физиологическое состояние. Расщепление гликогена дает энергию для синтеза стеролов и ненасыщенных жирных кислот, которые важны для пра-вильной работы дрожжевых мембран, особенно в анаэробных условиях. Поэтому содержание этих веществ может служить показателем жизнеспособности дрожжей [5].
В цитоплазме могут накапливаться свободные жирные кислоты в виде липидных скоплений. В соединении с фосфатами и белками они образуют фосфолипидные или фосфолипопротеидные гранулы, которые на срезах представляют собой либо гомогенные структуры, либо комплексы концентрически расположенных мембран. Липиды в дрожжевых клетках хорошо различимы в световом микроскопе и видны, как резко преломляющие свет, блестящие круглые тельца – «жировые капли». Таких капель в клетках может быть несколько, или же они сливаются в одну крупную глобулу, которая у некоторых видов, например, Cryptococcus terricola, Lipomyces starkeyi, может занимать большую часть клетки [1].
1.2 Морфология клеток дрожжей
При характеристике морфологии дрожжевых грибов обычно различают макро- и микроморфологические признаки, поскольку первые изучают визуально, а вторые – с помощью микроскопа. Макроморфология включает культуральные признаки, характеризующие рост культуры в жидких или на плотных средах. Макроморфологические признаки очень изменчивы и сильно зависят от состава среды и условий культивирования, поэтому они имеют весьма ограниченное значение в систематике дрожжей. Тем не менее, многие виды дрожжей существенно отличаются по характеру роста на скошенном агаре (см. рис. 1.2).
Рис. 1.2. Рост различных видов дрожжей на скошенном агаре
Или в виде гигантской колонии (см. рис. 1.3), что на практике дает возможность их быстрой предварительной идентификации
Рис. 1.3. Гигантские колонии дрожжей разных видов на сусло-агаре
Дрожжевые культуры, растущие на плотных средах, по консистенции бывают чаще всего пастообразными, а также слизистыми, иногда полностью стекающими на дно пробирки, вязкими, клейкими, кожистыми или крошащимися. Слизистый рост характерен для многих анаморфных базидиомицетовых дрожжей родов Cryptococcus, Rhodotorula, Sporobolomyces, образующих большое количество внеклеточных полисахаридов, а также для аскомицетовых почвенных дрожжей рода Lipomyces. У большинства аскомицетовых дрожжей колонии пастообразные, сухие, культура при росте на скошенном агаре не стекает на дно пробирки. Для дрожжеподобных грибов,образующих как одиночные клетки, так и мицелий, характерны колонии с ворсинчатым краем, который хорошо просматривается при просвечивании.
У большинства дрожжей колонии белые, часто приобретающие пристарении кремовый или слегка коричневатый оттенок. У некоторых аскоспоровых дрожжей, например, из родов Nadsonia или Lipomyces, старые колонии при обильном спорообразовании темнеют и становятся бурыми или шоколадными. Многие дрожжи образуют пигменты, окрашивающие их колонии в различные цвета. Наличие каротиноидных пигментов, придающих колониям красную, розовую, оранжевую или желтую окраску, характерно для базидиомицетовых дрожжей родов Rhodotorula, Sporobolomyces, Cystofilobasidium и др. Аскомицетовые дрожжи Metschnikowia pulcherrima образуют диффундирующий в среду красно-вишневый пигмент пульхерримин. Так называемые «черные дрожжи», формируют темно бурые или черные колонии за счет накопления меланиноподобных пигментов.
При росте в жидких средах дрожжи провоцируют помутнение, образование осадков, кольца на стенках пробирки, разные виды пленки. Как правило, рост в виде пленки характеризует способность дрожжей объединяться в мицелиальные структуры или свидетельствует об окислительном типе энергетического метаболизма.
Микроморфология дрожжей включает признаки, характеризующие отдельные клетки (форма, размеры), а также способы вегетативного и бесполого размножения и образуемые при этом структуры [1].
1.3 Размножение дрожжевых клеток
Ростом дрожжей называют увеличение числа их клеток, т. е. размножение. Дрожжи рода Saccharomyces способны размножаться вегетативным и половым путем. Дрожжевые клетки при нормальных условиях размножаются вегетативным путем – почкованием.
Хромосомный набор удваивается перед делением клеток, а после митоза одно из двух ядер переходит в дочернюю клетку. В процессе митоза ядерная мембрана не разрушается. Подготовка почки к полноценной клетке длится около 1 часа.
После отделения дочерней клетки на материнской клетке остается почечный рубец. По числу рубцов (от 4 до 6) можно узнать возраст клетки.
При недостатке питательных веществ или иных неблагоприятных условиях дрожжи размножаются половым путем. При этом клеточный метаболизм резко замедляется, обеспечивая устойчивость культуры в неблагоприятных условиях.
В среде с хорошими условиями питания споры развиваются и формируют клоны гаплоидных клеток. Гаплоидная клетка противоположного типа спаривания может сливаться и сформировать зиготы с диплоидной ядрой. Зигота начинает почковаться, образуя первую диплоидную почку, а затем образуется диплоидное поколение почкующихся клеток.
Дрожжи, имеющие устойчивые гаплоидную и диплоидную фазы, относят к гетероталличным [6].
Пивное сусло содержит все необходимые вещества для размножения клеток, поэтому, когда сусло сбирают, дрожжи развиваются только почками, не создавая споров [7].
Дрожжевые клетки, которые внесены в сусло и находятся в фазе покоя, имеют способность сбраживать, если они прошли все фазы клеточного цикла, т. е. завершили клеточное деление. Время, в течение которого все клетки прошли эти фазы, считается скоростью сбраживания [8].
На длительность и интенсивность отдельных фаз роста существенно влияют физиологическое состояние дрожжей; субстрат, содержащий все необходимые для роста питательные вещества; состав воды; рН; температура; концентрация кислорода в субстрате [9].
Систематика дрожжей основана на ряде морфологических и физиологических признаков. Различают 2 семейства:
1. Saccharomycetaceae. Размножение происходит почкованием, образованием сумок со спорами и у немногих родов делением. В этом семействе наиболее важное значение имеет род Saccharomyces, к которому относятся представители дрожжей, широко используемых в промышленности – винокурении, хлебопечении, пивоварении, производстве глицерина и др.
2. Non Saccharomycetaceae. Размножение только почкованием, без спорообразования. Сюда относится род Torula, некоторые виды которого используются для приготовления кефира, кумыса, "кормовых дрожжей".
Часто встречаются так называемые дрожжевидные грибы, которые размножаются, кроме почкования, также путем расчленения мицелия на отдельные клетки, называемые оидиями (Endomyces, Monilia, Oidium). Сюда относится молочная плесень, которая, развиваясь на кислых молочных продуктах и квашеных овощах, снижает кислотность их, что дает возможность развиваться гнилостным микробам. Она также может вызывать болезни детей (молочница) и молодняка животных. Некоторые авторы относят дрожжевидные грибы к несовершенным грибам [10].
1.4 Дрожжи в современной биотехнологии
Дрожжи как источник белка. Использование микробной биомассы для обогащения кормов белком и незаменимыми аминокислотами в условиях интенсивного животноводства является одной из важнейших задач будущего, поскольку человечество так развивается, что вряд ли сможет обеспечить себе пищу традиционными способами. Выращивание микроорганизмов не зависит от климатических и погодных условий, не требует посевных площадей, поддается автоматизации. Дрожжи – одна из самых перспективных групп микроорганизмов, способных получать белковые кормовые добавоки. Содержание белка в клетках некоторых штаммов дрожжей составляет от половины до 2/3 сухой массы, на долю незаменимых аминокислот приходится до 10 % (в белках сои, богатых лизином, его содержится не многим более 6 %).
Впервые дрожжи стали рассматривать как источник питания в годы первой мировой войны в Германии, где использовались как добавки для изготовления колбас. В первой половине XX в. возникла новая отрасль промышленности – производство белка одноклеточных организмов. Наша страна начала производить кормовые дрожжи в 30-е годы. Сельскохозяйственные отходы, например, солома, кокосовые кукурузы, опилки были подвергнуты гидролизу серой кислотой, получаемые гидролизаты были нейтрализованы и использовались для изготовления дрожжей. В этом производстве наиболее привлекательным является применение возобновляемых материалов, в частности древесины - запасы которых в стране пока довольно большие. В большинстве отходов основным компонентом является целлюлоза, а в гидролизатах будет преобладать глюкоза, которая усваивается всеми, без исключения, видами дрожжей. Таким образом, на гидролизатах можно выращивать самые разнообразные дрожжи, которые удовлетворяют технологическим требованиям. В гидролизатах древесины также присутствует большое количество ксилозы, поэтому здесь желательно использование видов, которые будут утилизировать пентозы. При этом перевозка сырья на заводы гидролиза оказывается дорогой, поэтому большинство стран имеют только местные мелкие кормовые дрожжи, что экономически и экологически более выгодное..
Первый крупнейший в мире завод кормовых дрожжей мощностью 70000 т. в год. был пущен в 1973 г. в Советском Союзе. В качестве сырья на нем использовали выделенные из нефти н-алканы и несколько видов дрожжей, которые были способны к быстрому росту на углеводородах: Candida maltosa, Candida guilliermondii, Candida lipolytica. В дальнейшем именно нефтяные отходы служили основным сырьем для производства дрожжевого белка, которое быстро росло и к середине 80-х гг. превысило млн. т. в год, причем кормовые белки в СССР получали в два раза больше, чем в других странах мира. Этому способствовала организация большой научно-исследовательской работы. Были подробно изучены специфические особенности окисления и ассимиляции углеводородов, кинетические параметры роста, была разработана технология культивирования их в больших ферментерах объемом в сотни кубических метров. Однако в последующем масштабы производства дрожжевого белка на углеводородах нефти резко снизился. Это произошло как в результате экономического кризиса 90-х гг., так и из-за целого ряда специфических проблем, с которыми связано это производство. Одна из них является необходимость очищения готового кормового продукта от остатков нефти, обладающих канцерогенными свойствами.
Другой пригодный вид сырья для производства микробного белка – метанол. На метаноле, как на единственном источнике углерода и энергии, способны развиваться около 25 видов дрожжей, в том числе Pichia polymorpha, Pichia anomala, Yarrowia lipolytica. Однако, более выгодным считается выращивание на метаноле метилотрофных бактерий, таких как Methylophilus methylotrophus, так как они используют одноуглеродные соединения более эффективно. Поэтому при росте на метаноле бактерии дают больше биомассы, чем дрожжи. Первая реакция окисления метанола у дрожжей катализируется оксидазой, а у метилотрофных прокариот – дегидрогеназой. Ведутся генноинженерные работы по переносу гена метанолдегидрогеназы из бактерий в дрожжи. Это позволит объединить технологические преимущества дрожжей с эффективностью роста бактерий.
Последние годы интенсивно изучаются дрожжи, которые обладают гидролитическими ферментами и способные расти на полисахаридах без их предварительного гидролиза. Использование подобных дрожжей поможет избежать дорогостоящую стадию гидролиза отходов, содержащих полисахаридов. Известно более 100 видов дрожжей, которые хорошо растут на крахмале как на единственном источнике углерода. Среди них особенно выделяются два вида, которые образуют как глюкоамилазы, так и ?-амилазы, растут на крахмале с высоким экономическим коэффициентом и могут не только ассимилировать, но и сбраживать крахмал: Schwanniomyces occidentalis и Saccharomycopsis fibuliger. Оба вида – перспективные продуценты белка и амилолитических ферментов на крахмалсодержащих отходах. Ведутся поиски и таких дрожжей, которые могли бы расщеплять нативную целлюлозу. Целлюлазы обнаружены у нескольких видов, например, у Trichosporon pullulans, однако активность этих ферментов низкая и о промышленном использовании таких дрожжей говорить пока не приходится. Дрожжи из рода Kluyveromyces хорошо растут на инулине – основном запасном веществе в клубнях топинамбура – важной кормовой культуры, которая также может быть использована для получения дрожжевого белка.
Еще один субстрат, пригодный для получения кормового белка – молочная сыворотка, побочный продукт сыроварения.
