Иммобилизация как путь повышения эффективности и стабильности
Высокая лабильность Ф к различным факторам окружающей среды (значению pH, температуре), быстрая инактивация в организме и выделение из организма, наличие антигенных свойств чужеродных организму белков – в значительной мере могут быть устранены при использовании Ф в иммобилизованном виде.
Иммобилизация Ф – это повышение их стабильности. Существует несколько общепринятых методов иммобилизации Ф, которую проводят в строго асептических условиях, но ни один из существующих методов иммобилизации биологически активных молекул, таких, как Ф, антитела, антигены, не является универсальным.
Самый простой способ иммобилизации Ф – физический метод (адсорбция на нерастворимом носителе). В основе метода лежат действия электростатических сил и сил поверхностного натяжения. Процедура иммобилизации состоит в смешивании при соответствующих условиях Ф и носителя, инкубации и отделении нерастворимого компонента смеси от растворимого центрифугированием или фильтрованием. Недостаток этого метода – непрочная связь Ф с носителем. Например, адсорбция Ф на носителе ДЭАЭ — сефадекс (диэтиламиноэтил) осуществляется за счёт множественных солевых связей. На такого рода связи влияют даже незначительные изменения pH, ионной силы, температуры и природы растворителя, что может приводить к десорбции фермента с носителя, десорбцию Ф может вызвать даже субстрат. Кроме солевых связей во взаимодействии Ф с носителем могут участвовать и другие слабые силы, например, водородные или ван-дер-ваальсовые.
Материалы, используемые для адсорбции Ф: алюминия оксид, бентонит, кальция карбонат, гель кальция фосфата, активированный уголь, целлюлоза, глина белая, коллаген, ионно-обменные смолы, фенольные полимеры, силикагель.
Адсорбция – мягкий метод иммобилизации, который, как правило, слабо влияет на каталитическую активность Ф.
Иммобилизация ферментов с помощью ковалентного связывания считается мягким методом. Способ основан на образовании химической связи между молекулами Ф и носителя. При этом важно, чтобы аминокислоты, необходимые для проявления каталитической активности Ф, не участвовали в ковалентном связывании с носителем. Способ ковалентной иммобилизации может приводить к снижению ферментативной активности. Инактивацию можно предотвратить, проводя иммобилизацию в присутствии субстрата, защищающего активный центр. Типичные водонерастворимые носители, используемые для ковалентной иммобилизации — агароза (сефароза), целлюлоза, декстран (сефадекс), сополимеры полиакриламида, полиаминостирол.
Для ковалентного присоединения требуется предварительная активация носителя. Активированный носитель может реагировать с определёнными группами Ф: ?- и ?-аминогруппами остатков лизина, функциональными группами остатков тирозина, гистидина, аргинина, цистеина. Например, носитель сефароза активирована бромцианом, что основано на реакции между бромцианом и гидроксильными группами сефарозы, образующиеся при этом имидокарбонатные группы могут реагировать со свободными аминогруппами Ф.
Для определения количества Ф, иммобилизованного на носителе, измеряют ферментативную активность исходного раствора, который инкубирован с носителем, и активность, остающуюся в растворе после завершения процесса иммобилизации. Разность между этими активностями соответствует теоретическому или максимальному количеству иммобилизованного Ф.