1 Способы культивирования
Культивирование – разведение, выращивание растений, злаков, растительных клеток, тканей, микроорганизмов, животных или органов в искусственных условиях.
В биотехнологической практике используются способы культивирования микроорганизмов: поверхностное, твердофазное, глубинное; периодическое (стационарное), непрерывное;
1) глубинный метод – глубинное, периодическое, мезофильное культивирование с применением монокультуры (например, выращивание кормовых и хлебопекарных дрожжей и др.);
2) поверхностный метод – поверхностное, периодическое (например, биосинтез лимонной кислоты и др.);
3) твердофазный метод – твердофазное, периодическое, мезофильное культивирование с применением монокультуры или микробных ассоциаций (например, биосинтез аваморина и других ферментов);
4) непрерывный метод – глубинное, непрерывное, мезофильное культивирование с применением монокультуры (реже микробных ассоциаций) (например, производство кормовых дрожжей и др.).
В промышленности используют: поверхностный, или твердофазный, и глубинный способ выращивания микроорганизмов.
Поверхностный осуществляется на твердых, сыпучих средах или на поверхности тонкого слоя жидкости. Пригоден только для аэрофилов. Основой питательной среды служат отходы различных производств (отруби, жмых, шелуха от семечек). Способ трудоемок, занимает много площадей, требует кондиционирования воздуха, трудно автоматизируется. Выращивают в основном грибы, получают ферментные препараты.
Выгодный способ – это глубинный, осуществляемый в специальных аппаратах – ферментерах. Клетки культуры суспендированы в жидкости, находятся во взвешенном состоянии. Имеются устройства, регулирующие и контролирующие рН, температуру, наличие кислорода и т.д. Экономически выгоден.
Поверхностное культивирование всегда периодическое; глубинное может быть периодическим и непрерывным.
Суть периодического состоит в том, что культура выращивается на несменяемой питательной среде. Весь объем среды загружают сразу в аппарат, вносят посевной материал (споры, вегетативные клетки), перемешивают и ведут ферментацию (выращивание) до определенного количества биомассы или продукта метаболизма. Преимущества непрерывного выращивания:
1) Процесс идет с равномерной скоростью выращивания;
2) Однородность и стандартность полученного продукта;
3) Высокая продуктивность;
4) Полная переработка субстрата;
5) Создается открытая система, которая легко автоматизируется.
2 Технологические особенности процессов ферментами
Технология микробиологического синтеза обязательно включает в себя в качестве основной стадию промышленного культивирования соответствующего микроорганизма-продуцента (ферментация). В условиях промышленного производства такое культивирование проводят по одному из следующих двух способов:
1. культивирование на твердых питательных средах или на поверхности тонкого слоя жидкой питательной среды (поверхностный способвыращивания продуцента);
2. культивирование соответствующего продуцента в большом объеме жидкой фазы, содержащей все необходимые для нормального роста и развития микроорганизма питательные вещества (глубинный способвыращивания продуцента).
Культивирование микроорганизмов на твердых питательных средах (поверхностное культивирование) можно представить в виде последовательности технологических операций. Простерилизованный и измельченный твердый питательный субстрат засевается выращенной в отделении «чистой культуры» заводской лаборатории культурой соответствующего микроорганизма. Среду с посевным материалом направляют в раздаточное устройство, где с помощью механических дозаторов осуществляется загрузка кюветов для выращивания. Перед загрузкой кюветы моют и стерилизуют паром. Загруженные кюветы помещают в специальные камеры, для роста культур микроорганизмов.
В качестве субстратов, используемых для культивирования микроорганизмов на твердых питательных средах, применяют, нестандартное сырье – различные отходы пищевой промышленности. Среди них наиболее часто используют пшеничные отруби, свекловичный жом, проросшие ячменные зерна, шелуха от сельскохозяйственных культур (риса, гречихи, подсолнуха). В качестве разрыхлителя субстрата используют древесные опилки.
Перед использованием готовый субстрат подвергают тщательной стерилизации. Наиболее часто стерилизацию проводят обработкой острым паром (более 120 С). В производстве сейчас стали использовать для стерилизации другие методы, например уничтожение микроорганизмов ?- или рентгеновскими лучами.
Выращенный в отделении «чистой» культуры посевной материал , подвергают микробиологическому и биохимическому контролю на отсутствие посторонней микрофлоры. Посевной материал считается пригодным для засева, если он обеспечивает при нормальной длительности культивирования на производственной среде необходимое по паспорту накопление целевого продукта или нужную ферментативную активность.
Все продуценты культивируемые поверхностным способом являются аэробами, то им для дыхания необходим интенсивный подвод воздуха.
Поэтому любая технологическая схема подготовки и циркуляции воздушного потока предусматривает его рецикл, в котором участвует до 90% воздуха. При этом циркулирующий воздух проходит через воздухоохладитель, а часть отработанного воздуха очищается на фильтрах от пыли и микробных клеток, а затем выбрасывается в атмосферу.
Проблема регулирования теплообмена в процессе культивирования имеет не менее важное значение. В ходе своего роста культуры выделяют значительное количество тепла. Выделение тепла в течение всего периода культивирования происходит неравномерно. В начале культивирования выделение тепла обычно в 10–20 раз больше чем в конце процесса. Поэтому необходим постоянный контроль за температурой внутри ростовой камеры и эффективный отвод избыточного тепла.
Решение проблемы теплообмена упрощается благодаря тому, что так же неравномерно в ходе культивирования происходит и потребление кислорода, при этом максимум потребления кислорода совпадает с максимумом тепловыделения. В конце культивирования потребление кислорода становится минимальным, одновременно уменьшается и выделение тепла. Это позволяет использовать холодный воздух, подаваемый в ферментер для съема и отвода выделяющегося в ходе культивирования тепла.
В процессе культивирования наблюдается снижение влаги в твердом субстрате. В начале процесса влажность питательной среды достигает 58–60%, к моменту окончания процесса эта величина может снизиться до уровня 30%. Поэтому для производственных условий важно в течении всего времени культивирования поддерживать величину влагосодержания на уровне не ниже 55–50%, что достигается предварительным увлажнением.
По сравнению с поверхностным способом культивирования микроорганизмов глубинный способ культивирования имеет ряд существенных преимуществ: при его использовании возможно менять состав питательной среды, добиваясь при этом максимального выхода целевого продукта с единицы объема ферментационного оборудования, в технологическом процессе значительно сокращается доля ручного труда (транспортировка питательной среды, загрузка, разгрузка аппарата) предлагает более простую последующую переработку биомассы микроорганизмов с целью выделения и очистки готового продукта.
Рассмотрим технологическую схему глубинного культивирования микроорганизмов на рис.1.
Рисунок 1 – Принципиальная технологическая схема глубинного культивирования микроорганизмов (1 – смеситель питательной среды; 2 – колонка для непрерывной стерили зации потока питательной среды; 3 –теплообменник – выдерживатель; 4 – теплообменник для охлаждения потока питательной среды; 5 – инокуляторы (или посевные аппараты); 6 – индивидуальный фильтр для очистки воздуха; 7 – ферментер; 8,9 – насосы; масляный фильтр для предварительной очистки воздуха; 11 – компрессор; 12 – головной фильтр для очистки воздуха)
Все процессы организации производства на промышленном уровне можно разделить на две группы - периодические и непрерывные.
При периодическом способепроизводства простерилизованный ферментер заполняется питательной средой, уже содержащей нужные микроорганизмы. Биохимические процессы в этом ферментере продолжаются от нескольких часов до нескольких дней. При этом типе культивирования клеточная культура может пройти все фазы своего развития:
1)Lag-фазу, или фазу задержанного роста, при которой клетки растут медленно и адаптируются к новой среде обитания в объеме ферментера;
2) Фазу ускорения – когда адаптация закончилась и клетки начинают интенсивно делиться;
3)Log-фазу, характеризующаяся интенсивным делением клеток и сбалансированностью роста всей популяции;
4) фазу замедленного роста, связанную с исчерпанием питательных субстратов и накоплением токсических продуктов метаболизма;
5)Const-фазуили стационарную фазу, при которой прирост новых клеток количественно равняется числу погибающих;
6) Фазу отмирания, характеризующуюся прогрессирующей гибелью клеток.
Рисунок 2 – Кривая роста бактериальной культуры при периодической ферментации (1 – лаг-фаза, 2 – фаза ускорения, 3 – экспоненциальная фаза, 4 – фаза замедления, 5 – стационарная фаза, 6 – фаза отмирания)
Синтез первичных метаболитов наиболее интенсивно идет с середины Log-фазы до середины стационарной. Ближе к концу стационарной фазы может начаться синтез вторичных метаболитов.
Периодически ферментер опорожняют, моют, стерилизуют, целевой продукт отправляют на очистку, и начинают новый цикл.
Системы, функционирующие в таких условиях, характеризуются как batch-системы. Большинство современных биотехнологических систем функционируют как batch-процессы, при которых однажды оптимизированные условия обеспечивают максимальное накопление целевого продукта.
Принепрерывном способе подача равных объемов сырья и отвод культуральной жидкости, содержащей клетки продуцента и целевой продукт осуществляется одновременно. Через некоторое время после начала процесса в таком ферментере устанавливается динамическое равновесие между процессами размножения клеток с одной стороны и процессами отмирания и вымывания живых клеток их аппарата с другой. В результате концентрация клеток устанавливается на определенном уровне, задаваемом технологическим режимом (скоростью протока, количеством питательных веществ, температурой). Теоретически такая сonst-фаза, при неизменных параметрах процесса культивирования может поддерживаться бесконечно долго. Ферментер, работающий в таком режиме, значительно более прост в управлении, по сравнению с аналогичным, работающим в периодическом режиме. Это обусловлено тем, что при постоянстве концентрации клеток продуцента постоянными являются и все их потребности (питательные вещества, воздух) и параметры процесса (тепловыделение, уровень рН, выделение целевого продукта).
Принцип непрерывного проточного культивирования похож на непрерывные процессы в химической технологии и подобно им может реализовываться по двум основным схемам:
1. процесс идеального (полного) вытеснения;
2. процесс идеального (полного) смешения.
Реактор для выращивания микроорганизмов в процессе полного вытеснения в общем виде представляет собой трубу, расположенную вертикально или горизонтально. При этом в один конец медленно втекает среда и посевной материал, а из другого конца вытекает культуральная жидкость. При этом из-за одинаковой скорости движения и отсутствия завихрений перемешивания слоев жидкости в реакторе не происходит (ламинарный режим). Уменьшение концентрации питательных веществ и накопление продуктов биосинтеза, а так - же клеточной биомассы происходит в таком реакторе не только во времени, но и в пространстве (от начала реактора к концу). В таком режиме обычно проводят анаэробное культивирование. Процесс полного вытеснения применяется в крупнотоннажных производствах в тех случаях, когда желательно избежать потери времени на опорожнение, стерилизацию и заполнение емкости (производство пива).
В процессе полного смешения рост культур микроорганизмов происходит в реакторе-ферментере при перемешивании культуральной среды с помощью мешалок (турбулентный режим). При этом в любой точке ферментера все параметры среды должны быть примерно одинаковы. Изменение всех параметров культивирования происходит только во времени. Этот метод наиболее широко применяется в аэробных процессах, как периодических, так и непрерывных.
Выбор между периодическим и непрерывными способами зависит прежде всего от экономических причин. Непрерывные процессы, лучше приспособлены для крупномасштабного производства, однако до настоящего времени большая часть микробиологических продуктов производится периодическим способом. Причинами этого в основном являются малотоннажность и широкий ассортимент производимых продуктов, а также особенности культивирования тех или иных их продуцентов, что не позволяет унифицировать как ферментеры, так и их технологическую оснастку. Все это вместе часто делает экономически невыгодным внедрение непрерывных технологий. Однако в крупномасштабном производстве растворителей, промышленных ферментов, кормового белка (аминокислот, витаминов и др.), биологической очистке сточных вод, непрерывные способы прочно заняли главенствующее положение [4].
Твердофазную ферментациюобычно реализуют в твердой, сыпучей или пастообразной среде, влажность которой составляет 30–80 %.
Различают три типа твердофазных процессов:
1. поверхностные процессы: слой субстрата, например соломы, не превышает 3–7 см («тонкий слой»); роль биореактора выполняют большие, площадью до нескольких квадратных метров, подносы из алюминия или культивационные камеры);
2.глубинные твердофазные процессы в неперемешиваемом слое («высокий слой»): биореакторы представляют собой глубокие открытые сосуды. Для аэробных процессов разработаны приспособления, обеспечивающие диффузионный и конъюктивный газообмен;
3. твердофазные процессы в перемешиваемой и аэрируемой массе субстрата, которая может быть гомогенной или состоять из частиц твердого субстрата, взвешенных в жидкости.
Если субстрат сыпучий, то отдельные твердые частицы его хорошо контактируют с воздухом, рост микроорганизмов в этом случае происходит главным образом на поверхности твердых частиц, а также в порах, заполненных либо водой, либо воздухом. Обеспечение микроорганизмов кислородом затрудняется с увеличением слоя субстрата. Перемешивание слоя не допускается, если культивируются мицелиальные микроорганизмы, например микромицеты, и из-за отсутствия перемешивания рост микроорганизмов происходит по принципу колонизации, поэтому часто возникает локальная нехватка питательных веществ. Другая проблема при твердофазной ферментации — отвод теплоты и поддержание постоянной температуры во всей ферментационной среде.
Твердофазные процессы имеют и преимущества по сравнению с процессами, протекающими в жидкой среде:
1. они требуют меньших затрат на Лабораторное оборудование и эксплуатацию;
2. характер субстрата облегчает отделение и очистку продукта;
3. низкое содержание воды в субстрате препятствует заражению культуры продуцента посторонней микрофлорой;
4. твердофазные процессы не связаны со сбросом в окружающую среду большого количества сточных вод.
Управляемый процесс твердофазной ферментации в промышленных условиях осуществлен при производстве ферментов с использованием микромицетов. Сыпучий субстрат с культурой инкубируют в тонком слое (3–7 см) в кюветах, размещенных в камерах, где поддерживают оптимальные температуру и влажность воздуха, обеспечивают принудительную циркуляцию газовой фазы вдоль поверхности ферментируемого субстрата. Воздух в данном случае является и аэрирующим, и теплоотводящим агентом.
Более толстый слой гранулированного крахмалсодержащего субстрата используют для протеинизации (до 20 %) корма при помощи Asp. niger. В данном случае применяют неинтенсивное перемешивание среды [3].
3 Что такое биосинтез
Биосинтез – процесс синтеза природных органических соединений живыми организмами. Путь биосинтезного соединения – это приводящая к образованию этого соединения последовательность реакций, как правило, ферментативных, но изредка встречаются и спонтанные реакции, обходящиеся без ферментативного катализа. Например, в процессе биосинтеза лейцина одна из реакций является спонтанной и протекает без участия фермента. Биосинтез одних и тех же соединений может идти различными путями из одних и тех же или из различных исходных соединений. Процессы биосинтеза играют исключительную роль во всех живых клетках.
Биосинтез – промышленное получение чего-либо (антибиотиков, гормонов, витаминов, аминокислот и других необходимых людям веществ) с помощью микроорганизмов [5].
