Частота полиморфизма гена рецептора витамина D в популяции Казахстана

Введение 3 Глава 1. Обзор литературы 9 1.1 Общая характеристика проблемы исследования 9 Глава 2. Материалы и методы исследования 12 2.1. Формирование групп исследования 12 2.2. Определение полиморфизмов гена VDR 13 2.2.1 Выделение геномной ДНК 14 2.2.2 Амплификация (проведение ПЦР) 15 2.2.3 Рестрикционный анализ 17 2.2.4 Разделение продуктов реакции амплификации и рестрикции методом вертикального гель-электрофореза 22 2.2.5 Детекция продуктов амплификации 23 2.2.6 Методика определения полиморфизма Cdx2 гена VDR с помощью аллель-специфичной ПЦР 23 2.3. Расходные материалы 25 2.4. Статистическая обработка результатов 27 2.4.1. Сравнение частот аллелей и генотипов. Критерий ?2 27 2.4.2. Проверка соблюдения в выборках закона Харди–Вайнберга 28 Глава 3. Результаты исследования 28 3.1. Исследование распределения генотипов полиморфного локуса rs10735810 гена FokI, у пациентов с туберкулезом легких и здоровых лиц 28 3.2. Изучение распределения генотипов полиморфного маркера BsmI гена VDR, кодирующего рецепторы витамин D, у пациентов с туберкулезом легких и здоровых лиц 32 3.3. Изучение распределения генотипов полиморфного маркера ApaI гена VDR, кодирующего рецепторы витамин D, у пациентов с туберкулезом легких и здоровых лиц 36 3.4. Изучение распределения генотипов полиморфного маркера TaqI гена VDR, кодирующего рецепторы витамин D, у пациентов с туберкулезом легких и здоровых лиц 40 3.5. Изучение распределения генотипов полиморфного маркера Cdx2 гена VDR, кодирующего рецепторы витамин D, у пациентов с туберкулезом легких и здоровых лиц 44 Глава 4. Обсуждение результатов 49 4.1. Обсуждение результатов поиска ассоциации полиморфизма ApaI, FokI, TaqI, BsmI, Cdx2 полиморфизмов гена к рецептору витамина D и оценки влияния генетических факторов на прогрессию тяжести течения патогенного воздействия туберкулезной инфекции 49 4.2. Обсуждение результатов рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого лечения пациентов с ТБ на месте демографического наблюдения в Республике Казахстан 60 Заключение 64 Выводы 68 Практические рекомендации 70 Список сокращений 71 Список литературы 72

1. Беляева И.В. и др. Кателицидины, витамин D и туберкулез // Вестник Санкт-Петербургского университета. 2013. № 3. С. 3–18. 2. Ерохин В.В., Земскова З.С. Современные представления о туберкулезном воспалении // Проблемы туберкулеза. – 2003. – № 3. – С. 11-21. 3. Каронова Т.Л. и др. Дефицит витамина D — фактор риска развития ожирения и сахарного диабета 2-го типа у женщин репродуктивного возраста // Артериальная гипертензия. 2012. Т. 18. № 1. С. 25–31. 4. Кушниренко С.В., Горбатова Л.П., Боголий О.М. Витамин D и хроническая болезнь почек // Почки. 2012. № 2. С. 37–43. 5. Плещева А.В., Пигарова Е.А., Дзеранова Л.К. Витамин D и метаболизм: факты, мифы и предубеждения // Ожирение и Метаболизм. 2012. № 2. С. 33–42. 6. Струков А.И. Кауфман О.Я. Гранулематозное воспаление и гранулематозные болезни. - М: Медицина, 1989. - 184с. 7. Хоменко А.Г. Проблемы наследственности при болезнях легких. – М.: Медицина, 1990. – 240 с. 8. Хренов А.А. и др. Роль витамин D-недостаточности/дефицита в формировании субклинической системной воспалительной реакции у больных деструктивными формами хронических неспецифических заболеваний легких // Крымский терапевтический журнал. 2012. № 2(19). С. 87–89. 9. Чуканова В.П., Поспелов Л. Е., Маленко А.Ф. Значение факторов наследственной предрасположенности при туберкулезе и других гранулематозных заболеваниях легких // Проблемы туберкулеза. – 2001. – №2. – С. 33-36. 10. Шкерская Н.Ю., Зыкова Т.А. Новые данные о влиянии витамина D на организм человека // Сибирский медицинский журнал. 2013. № 3952. С. 24–32. 11. Adams J.S. et al. Vitamin d-directed rheostatic regulation of monocyte antibacterial responses. // J. Immunol. 2009. Т. 182. № 7. С. 4289–95. 12. Agmon-Levin N. et al. Vitamin D in systemic and organ-specific autoimmune diseases. // Clin. Rev. Allergy Immunol. 2013. Т. 45. № 2. С. 256–66. 13. American Thoracic Society, CDC, Infectious Diseases Society of America. Treatment of tuberculosis. Morbidity and Mortality Weekly Report: Recommendations and Reports, 2003. 52 (RR-11): 1–77. 14. Andress D.L. Nonclassical aspects of differential vitamin D receptor activation: implications for survival in patients with chronic kidney disease. // Drugs. 2007. Т.67. С.1999–2012. 15. Andress D.L. Vitamin D in chronic kidney disease: a systemic role for selective vitamin D receptor activation. // Kidney Int. 2006. Т.69. С.33-43. 16. Anti-tuberculosis drug resistance in the world: fourth global report. Geneva, World Health Organization, 2008 (WHO/HTM/TB/2008.394). 17. Arabi A., Mahfoud Z., Zahed L. et al. Effect of age, gender and calciotropic hormones on the relationship between vitamin D receptor gene polymorphisms and bone mineral density. // Eur J Clin Nutr. 2010. Т.64(4). С.383-91. 18. Arai H., Miyamoto K.I., Yoshida M. et al. The polymorphism in the caudal-related homeodomain protein Cdx-2 binding element in the human vitamin D receptor gene. // J Bone Miner Res. 2001. Т.16(7). С.1256–64. 19. Armas L.A., Heaney R.P. Vitamin D: the iceberg nutrient. // J Ren Nutr. 2011. Т. 21(2). С.134-9. 20. Audi, L. Genetic determinants of bone mass / L. Audi, M. Garcia-Ramirez, A. Carrascosa // Horm. Res. – 1999. – Vol. 51, №3. – P. 105–123. 21. Bartacek A et al. Comparison of a four-drug fixed dose combination regimen with a single tablet regimen in smear-positive pulmonary tuberculosis. International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 2009. 13: 760–766. 22. Barthel T.K., Mathern D.R., Whitfield G.K. 1,25-Dihydroxyvitamin D3/VDR-mediated induction of FGF23 as well as transcriptional control of other bone anabolic and catabolic genes that orchestrate the regulation of phosphate and calcium mineral metabolism. // J Steroid Biochem Mol Biol. 2007. Т.103. С.381–388. 23. Bellamy R., Ruwende C., Corrah T. et al. Tuberculosis and chronic hepatitis B virus infection in Africans and variation in the vitamin D receptor gene. // J Infect Dis. 1999. Т.179. С.721–724. 24. Bellamy R., Beyers N., McAdam K. P. W. J. et al. Genetic susceptibility to tuberculosis in Africans: a genome-wide scan // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2000. – Vol. 97. – P. 8005-8009. 25. Bellamy R., Hill A. V. S. Genetic susceptibility to mycobacteria and other infectious pathogens in humans // Curr. Opin. Immunol. – 1998. – Vol. 10. – P. 483-487. 26. Benn B.S., Ajibade D., Porta A. Active intestinal calcium transport in the absence of transient receptor potential vanilloid type 6 and calbindin-D9k. // Endocrinology. 2008. Т.149. С.3196–3205. 27. Berndt S.I., Dodson J.L., Huang W.Y. A systemic review of vitamin D receptor gene polymorphisms and prostate cancer risk. // Urology. 2006. Т. 175. С. 1613-1623. 28. Bid H.K., Chaudhary H., Mittal R.D. Association of vitamin-D and calcitonin receptor gene polymorphism in paediatric nephrolithiasis. // Pediatr Nephrol. 2005. Т.20(6). С.773–6. 29. Bikle D. Nonclassic actions of vitamin D. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2009. Т. 94. № 1. С. 26–34. 30. Bornman L., Campbell S. J., Fielding K. et al. Vitamin D receptor polymorphisms and susceptibility to tuberculosis in west Africa: a case-control and family study // J. Infect. Dis. – 2004. – Vol. 190(9). – P. 1631-1641. 31. Brancaccio D., Bommer J., Coyne D. Vitamin D receptor activator selectivity in the treatment of secondary hyperparathyroidism: understanding the differences among therapies. // Drugs. 2007. Т.67. С.1981–1998. 32. Brehm J.M. et al. Serum vitamin D levels and severe asthma exacerbations in the Childhood Asthma Management Program study. // J. Allergy Clin. Immunol. 2010. Т. 126. № 1. С. 52–8.e5. 33. Brown A.J. et al. 1Alpha,25-dihydroxy-3-epi-vitamin D3, a natural metabolite of 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3, is a potent suppressor of parathyroid hormone secretion. // J. Cell. Biochem. 1999. Т. 73. № 1. С. 106–13. 34. Brown S.B., Brierley T.T., Palanisamy N. et al. Vitamin D receptor as a candidate tumor-suppressor gene in severe hyperparathyroidism of uremia. // J Clin Endocrinol Metab. 2000. Т.85(2). С.868–72. 35. Cadranel J., Hance A. J., Milleron B. et al. The production of 1,25(OH)2D3 by cells recovered by bronchoalveolar lavage and the role of this metabolite in calcium homeostasis // Am. Rev. Respir. Dis. – 1988. – Vol. 138. – P. 984-989. 36. Campbell M.J., Adorini L. The vitamin D receptor as a therapeutic target. // Expert Opin Ther Targets. 2006. Т.10. С.735–748. 37. Cantorna M.T. Vitamin D and multiple sclerosis: an update. // Nutr. Rev. 2008. Т. 66. № 10 Suppl 2. С. S135–8. 38. Chan T.Y. et al. A study of calcium and vitamin D metabolism in Chinese patients with pulmonary tuberculosis. // J. Trop. Med. Hyg. 1994. Т. 97. № 1. С. 26–30. 39. Chan T. Y. Vitamin D deficiency and susceptibility to tuberculosis // Calcif. Tissue. Int. – 2000. – Vol. 66(6). – P. 476-478. 40. Chen C., Liu Q., Zhu L. Vitamin D receptor gene polymorphisms on the risk of tuberculosis, a meta-analysis of 29 case-control studies. PLoS One. 2013. Т. 8(12). С. 838-43. 41. Chen K.T., Malo M.S., Moss A.K. Identification of specific targets for the gut mucosal defense factor intestinal alkaline phosphatase. // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010. Т.299. С.467–475. 42. Chen T.C., Lu Z., Holick M.F. Photobiology of vitamin D // Vitamin D: physiology, molecular biology, and clinical applications / под ред. H. MF. , 2010. С. 35–60. 43. Cheskis B.J., Freedman L.P., Nagpal S. Vitamin D receptor ligands for osteoporosis. // Curr Opin Investig Drugs. 2006. Т.7. С. 906–911. 44. Christakos S. et al. Vitamin D: metabolism. // Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 2010. Т. 39. № 2. С. 243–53, table of contents. 45. Colli E., Rigatti P., Montorsi F. et al. BXL628, a novel vitamin D3 analog arrests prostate growth in patients with benign prostatic hyperplasia: a randomized clinical trial. // Eur Urol. 2006. Т.49. С.82–86. 46. Connor J, Rafter N, Rodgers A. Do fixed-dose combination pills or unit-of-use packaging improve adherence? A systematic review. Bulletin of the World Health Organization, 2004. 82: 935–939. 47. Corbett E.L. et al. The growing burden of tuberculosis: global trends and interactions with the HIV epidemic. // Arch. Intern. Med. 2003. Т. 163. № 9. С. 1009–21. 48. Correa-Cerro L., Berthon P., Haussler J. et al. Vitamin D receptor polymorphisms as markers in prostate cancer. // Hum Genet. 1999. Т.105 (3). С.281–7. 49. Crescioli C., Morelli A., Adorini L. et al. Human bladder as a novel target for vitamin D receptor ligands. // J Clin Endocrinol Metab. 2005. Т.90. С.962–972. 50. Cross H.S. Extrarenal vitaminDhydroxylase expression and activity in normal and malignant cells: modification of expression by epigenetic mechanisms and dietary substances. // Nutr Rev. 2000. Т.65. С.S108-S112. 51. Crowle A.J., Ross E.J., May M.H. Inhibition by 1,25(OH)2-vitamin D3 of the multiplication of virulent tubercle bacilli in cultured human macrophages. // Infect. Immun. 1987. Т. 55. № 12. С. 2945–50. 52. Dardenne O., Prud’homme J., Arabian A. Targeted inactivation of the 25-hydroxyvitamin D3–1a-hydroxylase gene (CYP27B1) creates an animal model of pseudovitamin D-deficiency rickets. // Endocrinology. 2001. Т.142. С.3135–3141. 53. DeLuca G.C., Kimball S.M., Kolasinski J. Review: the role of vitamin D in nervous system health and disease. // Neuropathol Appl Neurobiol. 2013. Т. 39(5). С. 458-84. 54. Demay M. Muscle: a nontraditional 1,25-dihydroxyvitamin D target tissue exhibiting classic hormone-dependent vitamin D receptor actions. // Endocrinology. 2003. Т.144. С.5135–5137. 55. Denis M. Killing of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: activation by cytokines and cacitriol // Clin. Exp. Immunol. – 1991. – Vol. 84. – P. 200-206. 56. Determinants of hip axis length in women aged 10-89 years: a twin study / L. Flicker [et al.] // Bone. – 1996. – Vol. 18. – P. 41–45. 57. Determinants of peak bone mass: clinical and genetic analyses in a young female Canadian cohort / L.A. Rubin [et al.] // J. Bone Miner. Res. – 1999. – Vol. 14, №4. – P. 633–643. 58. Dietrich T., Joshipura K.J., Dawson-Hughes B. et al. Association between serum concentrations of 25-hydroxyvitamin D3 and periodontal disease in the US population. // Am J Clin Nutr. 2004. Т.80. С.108-113. 59. Dobnig H., Pilz S., Scharnagl H. et al. Independent association of low serum 25-hydroxyvitamin D and 1,25-dihydroxyvitamin D levels with all-cause and cardiovascular mortality. // Arch Intern Med. 2008. Т.168. С.1340-1349. 60. Eisman, J.A. Genetics, calcium intake and osteoporosis / J.A. Eisman // Proc. Nutr. Soc. – 1998. – Vol. 57, №2. – P. 187–193. 61. Espinal MA et al. Determinants of drug-resistant tuberculosis: analysis of 11 countries. International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 2001. 5: 887–893. 62. Espinal MA et al. Standard short-course chemotherapy for drug-resistant tuberculosis: treatment outcomes in 6 countries. Journal of the American Medical Association, 2000. 283: 2537–2545. 63. Fang Y., van Meurs J.B., Bergink A.P. et al. Сdx-2 polymorphism in the promoter region of the human vitamin D receptor gene determines susceptibility to fracture in the elderly. // J Bone Miner Res. 2006. Т.18. С.1632-1641. 64. Fang Y., van Meurs J.B., d'Alesio A. et al. Promoter and 3?-untranslated region haplotypes in the vitamin D receptor gene predispose to osteoporotic fracture: the Rotterdam study. // Am J Hum Gent. 2005. Т. 77. С. 807-823, 65. Feldman D., J Malloy P. Mutations in the vitamin D receptor and hereditary vitamin D-resistant rickets. // Bonekey Rep. 2014. T. 5. № 3. С. 510. 66. Fleet J.C. et al. 1 alpha,25-(OH)2-vitamin D3 analogs with minimal in vivo calcemic activity can stimulate significant transepithelial calcium transport and mRNA expression in vitro. // Arch. Biochem. Biophys. 1996. Т. 329. № 2. С. 228–34. 67. Forster R.E., Jurutka P.W., Hsieh J.C. Vitamin D receptor controls expression of the anti-aging klotho gene in mouse and human renal cells. // Biochem Biophys Res Commun. 2011. Т.414. С.557–562. 68. Fretz J.A., Zella L.A., Kim S. et al. 1,25- Dihydroxyvitamin D3 regulates the expression of low-density lipoprotein receptor-related protein 5 via deoxyribonucleic acid sequence elements located downstream of the start site of transcription. // Mol Endocrinol. 2006. Т.20. С.2215–2230. 69. Gao L., Tao Y., Zhang L. Vitamin D receptor genetic polymorphisms and tuberculosis: updated systematic review and meta-analysis. // Int J Tuberc Lung Dis. 2010. Т. 14(1). С. 15-23. 70. Gardner D.G., Chen S., Glenn D.J. Vitamin D and the heart. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2013. Т. 305. № 9. С. R969–77. 71. Garland C.F., Garland F.C., Gorham E.D. et al. The role of vitamin D in cancer prevention. // Am J Public Health. 2006. Т.96. С.252-261. 72. Garnero, P. Bone marrow abnormalities on magnetic resonance imaging are associated with type II collagen degradation in knee osteoarthritis: a three-month longitudinal study / P. Garnero, C. Peterfy, S. Zaim, M. Schoenharting // Arthritis Rheum. – 2005. – Vol. 52, №9. – P. 2822–2829. 73. Genetic control of bone density and turnover: role of the collagen 1alpha1, estrogen receptor, and vitamin D receptor genes / M.A. Brown [et al.] // J. Bone Miner. Res. – 2001. – Vol. 16, №4. – P. 758–764. 74. Genetic determination of Colles' fracture and differential bone mass in women with and without Colles' fracture / H.W. Deng [et al.] // J. Bone Miner. Res. – 2000. – Vol. 15. – P. 1243–1252. 75. Gibney K.B., MacGregor L., Leder K. et al. Vitamin D deficiency is associated with tuberculosis and latent tuberculosis infection in immigrants from sub-Saharan Africa. // Clin Infect Dis. 2008. Т.46. С.43–446. 76. Giovannucci E., Liu Y., HollisB.W. et al. 25-hydroxyvitamin D and risk of myocardial infarction in men: a prospective study. // Arch Intern Med. 2008. Т.168. С.1174-1180. 77. Glossmann H.H. Origin of 7-dehydrocholesterol (provitamin D) in the skin. // J. Invest. Dermatol. 2010. Т. 130. № 8. С. 2139–41. 78. Griffin M. D., Xing N., Kumar R. Vitamin D and its analogs as regulators of immune activation and antigen presentation // Annu. Rev. Nutr. – 2003. – Vol. 23. – P. 117-145. 79. Gross C., Eccleshall T.R., Malloy P.J. et al. The presence of a polymorphism at the translation initiation site of the vitamin D receptor gene is associated with low bone mineral density in postmenopausal Mexican-American women. // J Bone Miner Res. 1996. Т. 11(12). С. 1850–5. 80. Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis: emergency update 2008. Geneva, World Health Organization, 2008. (WHO/HTM/TB/2008.402). 81. Halsall J.A., Osborne J.E., Pringle J.H. Vitamin D receptor gene polymorphisms, particularly the novel A-1012G promoter polymorphism, are associated with vitamin D3 responsiveness and nonfamilial susceptibility in psoriasis. // Pharmacogenet Genomics. 2005. Т. 15(5). С.349–55. 82. Han J., Colditz G.A., Hunter D.J. Polymorphisms in the MTHFR and VDR genes and skin cancer risk. // Carcinogenesis. 2007. Т.28. С.390-397. 83. Haussler M.R., Jurutka P.W., Mizwicki M. Vitamin D receptor (VDR)-mediated actions of 1?,25(OH)?vitamin D?: genomic and non-genomic mechanisms. // Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2011. Т. 25(4). С. 543-59. 84. Haussler M.R., Whitfield G.K., Haussler C.A. et al. Nuclear vitamin D receptor: natural ligands, molecular structure–function, and transcriptional control of vital genes. // Academic Press. 2011. Т.11. С.137–170. 85. Haussler M.R., Whitfield G.K., Kaneko I. Molecular mechanisms of vitamin D action. // Calcif Tissue Int. 2013. Т. 92(2). С. 77-98. 86. Haussler M.R., Whitfield G.K., Kaneko I. The role of vitamin D in the FGF23, klotho, and phosphate bone-kidney endocrine axis. // Rev Endocr Metab Disord. 2012. Т.13. С. 57–69. 87. Heilberg I.P., Teixeira S.H., Martini L.A. Vitamin D receptor gene polymorphism and bone mineral density in hypercalciuric calciumstone-forming patients. // Nephron. 2002. Т. 90(1). С.51–7. 88. Hilger J., Friedel A., Herr R. A systematic review of vitamin D status in populations worldwide. // Br J Nutr. 2014. Т. 111(1). С. 23-45. 89. Hill A. V. S. Genetics and genomics of infectious disease susceptibility // Brit. Med. Bull. – 1999. – Vol. 55, №2. – P. 401-413. 90. Hmama Z., Sendide K., Talal A. Quantitative analysis of phagolysosome fusion in intact cells: inhibition by mycobacterial lipoarabinomannan and rescue by an 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3-phosphoinositide 3-kinase pathway. // J Cell Sci. 2004. Т.117. С.2131–2140. 91. Holick M. et al. Photosynthesis of previtamin D3 in human skin and the physiologic consequences // Science (80-. ). 1980. Т. 210. № 4466. С. 203–205. 92. Holick M.F. Sunlight and vitamin D for bone health and prevention of autoimmune diseases, cancers, and cardiovascular disease. // Am J Clin Nutr. 2004. Т.80. С.1678-1688. 93. Holick M.F. Vitamin D deficiency. // N. Engl. J. Med. 2007. Т. 357. № 3. С. 266–81. 94. Holick M.F. et al. Evaluation, treatment, and prevention of vitamin D deficiency: an Endocrine Society clinical practice guideline. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2011. Т. 96. № 7. С. 1911–30. 95. Hossein-nezhad A., Spira A., Holick M.F. Influence of vitamin D status and vitamin D3 supplementation on genome wide expression of white blood cells: a randomized double-blind clinical trial. // PLoS One. 2013. Т. 8. № 3. С. e58725. 96. Houben E.N., Nguyen L., Pieters J. Interaction of pathogenic mycobacteria with the host immune system. // Curr Opin Microbiol. 2006. Т.9. С.76–85. 97. Houghton L.A., Vieth R. The case against ergocalciferol (vitamin D2) as a vitamin supplement. // Am. J. Clin. Nutr. 2006. Т. 84. № 4. С. 694–7. 98. Hutchinson P.E., Osborne J.E., Lear J.T. et al. Vitamin D receptor polymorphisms are associated with altered prognosis in patients with malignant melanoma. // Clin Cancer Res. 2006. Т. 6(2). С.498–504. 99. Ikuyama T., Hamasaki T., Inatomi H. et al. Association of vitamin D receptor gene polymorphism with renal cell carcinoma in Japanese. // Endocr J. 2007. Т.49(4). С.433–8. 100. Ingles S.A., Ross R.K., Yu M.C. et al. Association of prostate cancer risk with genetic polymorphisms in vitamin D receptor and androgen receptor. // J Natl Cancer Inst. 1997. Т. 89(2). С.166–172. 101. Ingles S.A., Wang J., Coetzee G.A. Vitamin D receptor polymorphisms and risk of colorectal adenomas (United States) // Cancer Causes Control. 2001. Т. 12(7). С.607–14. 102. Ingraham B.A., Bragdon B., Nohe A. Molecular basis of the potential of vitamin D to prevent cancer // Curr. Med. Res. Opin. 2008. Т. 24. № 1. С. 139–149. 103. International Standards for Tuberculosis Care (ISTC), 2nd ed. The Hague, Tuberculosis Coalition for Technical Assistance, 2009. 104. Jones G., Strugnell S.A., DeLuca H.F. Current understanding of the molecular actions of vitamin D. // Physiol. Rev. 1998. Т. 78. № 4. С. 1193–231. 105. Joshi L., Ponnana M., Penmetsa S.R. Serum vitamin D levels and VDR polymorphisms (BsmI and FokI) in patients and their household contacts susceptible to tuberculosis. // Scand J Immunol. 2014. Т. 79(2). С.113-9. 106. Khan M.I., Bielecka Z.F., Najm M.Z. Vitamin D receptor gene polymorphisms in breast and renal cancer: current state and future approaches (review). // Int J Oncol. 2014. Т. 44(2). С. 349-63. 107. Khanal R.C., Nemere I. Endocrine regulation of calcium transport in epithelia. // Clin Exp Pharmacol Physiol. 2008. Т.35. С.1277–1287. 108. Kilkkinen A., Knekt P., Ato A. et al. VitaminDstatus and the risk of cardiovascular disease death. // AmJ Epidemiol. 2009. Т.170. С.1032-1039. 109. Kim H.S., Newcomb P.A., Ulrich C.M. et al. Vitamin D receptor polymorphism and the risk of colorectal adenomas: evidence of interaction with dietary vitamin D and calcium. // Cancer Epidemiol Biomark Prev. 2001. Т.10(8). С.869–74. 110. Kim M.S., Kondo T., Takada I. DNA demethylation in hormone-induced transcriptional derepression. // Nature. 2009. Т. 461. С.1007–1012. 111. Kim S., Yamazaki M., Shevde N.K. Transcriptional control of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand by the protein kinase A activator forskolin and the transmembrane glycoprotein 130-activating cytokine, oncostatin M, is exerted through multiple distal enhancers. // Mol Endocrinol. 2006. Т.21. С.197–214. 112. Kim S., Yamazaki M., Zella L.A. et al. Activation of receptor activator of NF-kappaB ligand gene expression by 1,25-dihydroxyvitamin D3 is mediated through multiple long-range enhancers. // Mol Cell Biol. 2006. Т. 26. С.6469–6486. 113. Krishnan V., Moore T.L., Ma Y.L. Parathyroid hormone bone anabolic action requires Cbfa1/Runx2-dependent signaling. // Mol Endocrinol. 2003. Т.17. С. 423–435. 114. Labuda M., Ross M. V., Fujiwara T. M. et al. Two hereditary defects related to vitamin D metabolism map to the same region of human chromosome 12q.II // Cytogenet. Cell Genet. – 1991. - Vol. 58. – P. 1978. 115. Lappe J., Travers-Gustafson D., Davies K.M. et al. Vitamin D and calcium supplementation reduces cancer risk: results of a randomized trial. // Am J Clin Nutr. 2007. Т.85. С.1586-1591. 116. Leandro A.C., Rocha M.A., Cardoso C.S. Genetic polymorphisms in vitamin D receptor, vitamin D-binding protein, Toll-like receptor 2, nitric oxide synthase 2, and interferon-gamma genes and its association with susceptibility to tuberculosis. // Braz J Med Biol Res. 2009. Т. 42(4). С.312-22. 117. Lee N.K., Sowa H., Hinoi E. Endocrine regulation of energy metabolism by the skeleton. // Cell. 2007. Т.130. С. 456–46. 118. Lehmann B. The vitamin D3 pathway in human skin and its role for regulation of biological processes. // Photochem. Photobiol. 2005. Т. 81. № 6. С. 1246–51. 119. Levin A., Li Y.C. Vitamin D and its analogues: do they protect against cardiovascular disease in patients with kidney disease // Kidney Int. 2005. Т.68. С.1973–1981. 120. Lewis S.J., Baker I., Davey Smith G. Meta-analysis of vitamin D receptor polymorphisms and pulmonary tuberculosis risk. // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2005. Т. 9. № 10. С. 1174–7. 121. Li C., Liu Z., Wang L.E. et al. Haplotype and genotypes of the VDR gene and cutaneous melanoma risk in non-Hispanic whites in Texas: a case—control study. // Int J Cancer. 2008. Т.22. С.2077-2084. 122. Li M., Indra A.K., Warot X. Skin abnormalities generated by temporally controlled RXRalpha mutations in mouse epidermis. // Nature. 2000. Т.407. С.633–636. 123. Li Y.C., Kong J., Wei M. et al. 1,25-Dihydroxyvitamin D(3) is a negative endocrine regulator of the renin-angiotensin system. // J Clin Invest. 2002. Т.110. С.229–238. 124. Lieben L., Carmeliet G., Masuyama R. Calcemic actions of vitamin D: effects on the intestine, kidney and bone. // Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2011. Т.25. С.561–572. 125. Liu W., Cao W. C., Zhang C. Y. et al. VDR and NRAMP1 gene polymorphisms in susceptibility to pulmonary tuberculosis among the Chinese Han population: a case-control study // Int. J. Tuberc. Lung Dis. – 2004. – Vol. 8(4). – P. 428-434. 126. Liu P.T., Stenger S., Li H. et al. Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response. // Science. 2006. Т.311. С.1770–1773. 127. Liu P.T., Stenger S., Tang D.H. Cutting edge: vitamin D-mediated human antimicrobial activity against Mycobacterium tuberculosis is dependent on the induction of cathelicidin. // J Immunol. 2007. Т.179. С.2060–2063. 128. Martineau A.R., Honecker F.U., Wilkinson R.J. Vitamin D in the treatment of pulmonary tuberculosis. // J Steroid Biochem Mol Biol. 2007. Т.103. С.793–798. 129. Masuda S., Byford V., Arabian A. Altered pharmacokinetics of 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D3 in the blood and tissues of the 25-hydroxyvitamin D-24-hydroxylase (Cyp24a1) null mouse. // Endocrinology. 2005. Т.146. С. 825–834. 130. McDonald, C.F. Calcitriol does not prevent bone loss in patients with asthma receiving corticosteroid therapy: a double-blind placebo- controlled trial / C.F. McDonald, R.M. Zebaze, E. Seeman // Osteoporos Int. – 2006. – Vol. 17, №10. – P. 1546–1551. 131. Menzies D et al. Effect of duration and intermittency of rifampin on tuberculosis treatment outcomes: a systematic review and meta-analysis. PloS Medicine, 2009. 6: e1000146. 132. Messerlian S., Gao X., St-Arnaud R. The 3-epi- and 24-oxo-derivatives of 1?,25 dihydroxyvitamin D3 stimulate transcription through the vitamin D receptor // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2000. Т. 72. № 1-2. С. 29–34. 133. Meyer M.B., Watanuki M., Kim S. et al. The human transient receptor potential vanilloid type 6 distal promoter contains multiple vitamin D receptor binding sites that mediate activation by 1,25-dihydroxyvitamin D3 in intestinal cells. // Mol Endocrinol. 2006. Т.20. С.1447–1461. 134. Mheid I. Al et al. Vitamin D and cardiovascular disease: is the evidence solid? // Eur. Heart J. 2013. Т. 34. № 48. С. 3691–8. 135. Michos E.D., Melamed M.L. Vitamin D and cardiovascular disease risk. // Curr Opin Clin. Nutr Metab Care. 2008. Т.11. С.7–12. 136. Milat F., Ng K.W. Is Wnt signalling the final common pathway leading to bone formation // Mol Cell Endocrinol. 2009. Т.310. С. 52–62. 137. Min B. Effects of Vitamin D on Blood Pressure and Endothelial Function. // Korean J. Physiol. Pharmacol. 2013. Т. 17. № 5. С. 385–392. 138. Mitchison DA. Basic mechanisms of chemotherapy. Chest, 1979. 76 (6 Suppl.): 771–781. 139. Morelli A., Vignozzi L., Filippi S. et al. BXL-628, a vitamin D receptor agonist effective in benign prostatic hyperplasia treatment, prevents RhoA activation and inhibits RhoA/Rho kinase signaling in rat and human bladder. // Prostate. 2007. Т.67. С.234–247. 140. Morrison N.A., Qi J.C., Tokita A. et al. Prediction of bone-density from vitamin-D receptor alleles. // Nature. 1994. Т. 367(6460). С. 284–7. 141. Morrison N.A., Yeoman R., Kelly P.J. Contribution of transacting factor alleles to normal physiological variability — vitamin-D receptor gene polymorphisms and circulating osteocalcin. // Proc Natl Acad Sci. 1992. Т. 89(15). С. 6665–9. 142. Mossetti G., Vuotto P., Rendina D. et al. Association between vitamin D receptor gene polymorphisms and tubular citrate handling in calcium nephrolithiasis. // J Intern Med. 2003. Т.253(2). С.194–200. 143. Munger K.L. et al. Serum 25-hydroxyvitamin D levels and risk of multiple sclerosis. // JAMA. 2006. Т. 296. № 23. С. 2832–8. 144. Nava-Aguilera E. и др. Risk factors associated with recent transmission of tuberculosis: systematic review and meta-analysis. // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2009. Т. 13. № 1. С. 17–26. 145. Nishijima S., Sugaya K., Naito A. Association of vitamin D receptor gene polymorphism with urolithiasis. // J Urol. 2002. Т. 167(5). С.2188–91. 146. Nnoaham K.E., Clarke A. Low serum vitamin D levels and tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. // Int. J. Epidemiol. 2008. Т. 37. № 1. С. 113–9. 147. Ntais C., Polycarpou A., Ioannidis J.P.A. Vitamin D receptor gene polymorphisms and risk of prostate cancer: A meta-analysis. // Cancer Epid, Biomarkers & Prev. 2003. Т. 12. С. 1395-1402, 148. Oh J. et al. 1,25(OH)2 vitamin d inhibits foam cell formation and suppresses macrophage cholesterol uptake in patients with type 2 diabetes mellitus. // Circulation. 2009. Т. 120. № 8. С. 687–98. 149. Oury F., Sumara G., Sumara O. Endocrine regulation of male fertility by the skeleton. // Cell. 2011. Т.144. С.796–809. 150. Ozkaya O., Soylemezoglu O., Misirlioglu M. Polymorphisms in the vitamin D receptor gene and the risk of calcium nephrolithiasis in children. // Eur Urol. 2005. Т.44(1). С.150–4. 151. Peiris A.N., Youssef D., Grant W.B. Secondary hyperparathyroidism: benign bystander or culpable contributor to adverse health outcomes? // South. Med. J. 2012. Т. 105. № 1. С. 36–42. 152. Peleg S., Ismail A., Uskokovic M.R. et al. Evidence for tissue- and cell-type selective activation of the vitamin D receptor by Ro-26-9228, a noncalcemic analog of vitamin D3. // J Cell Biochem. 2003. Т.88. С.267–273. 153. Peters U., McGlynn K.A., Chatterjee N. et al. Vitamin D, calcium, and vitamin D receptor polymorphism in colorectal adenomas. // Cancer Epidemiol Biomark Prev. 2001. Т.10(12). С.1267–74. 154. Pilz S., Dobnig H., Fischer J.E. et al. Low vitamin D levels predict stroke in patients referred to coronary angiography. // Stroke 2008. Т.9. С.2611-2613. 155. Pinzone M.R. et al. Vitamin D deficiency in HIV infection: an underestimated and undertreated epidemic. // Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2013. Т. 17. № 9. С. 1218–32. 156. Prabhu Anand S., Selvaraj P., Narayanan P.R. Effect of 1,25 dihydroxyvitamin D3 on intracellular IFN-gamma and TNF-alpha positive T cell subsets in pulmonary tuberculosis. // Cytokine. 2009. Т. 45. № 2. С. 105–10. 157. Quy HT et al. Drug resistance among failure and relapse cases of tuberculosis: is the standard re-treatment regimen adequate? International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 2003. 7: 631–636. 158. Rational Pharmaceutical Management Plus Program. Managing pharmaceuticals and commodities for tuberculosis: a guide for national tuberculosis programs. Arlington, VA: Management Sciences for Health, 2005. 159. Razzaque M.S. The FGF23-Klotho axis: endocrine regulation of phosphate homeostasis. // Nat Rev Endocrinol. 2009. Т.5. С.611–619. 160. Rehan V.K. et al. 1?,25-Dihydroxy-3-epi-vitamin D3, a natural metabolite of 1?,25-dihydroxy vitamin D3: production and biological activity studies in pulmonary alveolar type II cells // Mol. Genet. Metab. 2002. Т. 76. № 1. С. 46–56. 161. Rivas-Santiago B., Hernandez-Pando R., Carranza C. et al. Expression of cathelicidin LL-37 during Mycobacterium tuberculosis infection in human alveolar macrophages,monocytes, neutrophils, and epithelial cells. // Infect Immun. 2008. Т.76. С.935– 941. 162. Rohan T. Epidemiological studies of vitamin D and breast cancer. // Nutr Rev. 2007. Т.65. С.S80-S83. 163. Rook G.A. et al. Vitamin D3, gamma interferon, and control of proliferation of Mycobacterium tuberculosis by human monocytes. // Immunology. 1986. Т. 57. № 1. С. 159–63. 164. Rosa M. Di et al. Immuno-modulatory effects of vitamin D3 in human monocyte and macrophages. // Cell. Immunol. 2012. Т. 280. № 1. С. 36–43. 165. Ross A.C. et al. The 2011 report on dietary reference intakes for calcium and vitamin D from the Institute of Medicine: what clinicians need to know. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2011. Т. 96. № 1. С. 53–8. 166. Roth D. E., Soto G., Arenas F. et al. Association between vitamin D receptor gene polymorphisms and response to treatment of pulmonary tuberculosis // J. Infect. Dis. – 2004. – Vol. 190(5). – P.920-927. 167. Ruggiero M., Pacini S., Amato M. et al. Association between vitamin D receptor gene polymorphism and nephrolithiasis. // Miner Electrolyte Metab. 1999. Т.25(3). С.185–90. 168. Saijo T., Ito M., Takeda E. et al. A unique mutation in the vitamin-D receptor gene in 3 Japanese patients with vitamin-D dependent rickets type-Ii — utility of single-strand conformation polymorphism analysis for heterozygous carrier detection. // Am J Hum Genet. 1991. Т.49 (3). С. 668–73. 169. Santonocito C., Capizzi R., Concolino P. et al. Association between cutaneous melanoma, Breslow thickness and vitamin D receptor BsmI polymorphism. // Br J Dermatol. 2007. Т.56. С.277-282. 170. Saramaki A., Diermeier S., Kellner R. Cyclical chromatin looping and transcription factor association on the regulatory regions of the p21 (CDKN1A) gene in response to 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3. // J Biol Chem. 2009. Т.284. С.8073–8082. 171. Sasidharan P.K., Rajeev E., Vijayakumari V. Tuberculosis and vitamin D deficiency. // J. Assoc. Physicians India. 2002. Т. 50. С. 554–8. 172. Schlingmann K.P., Kaufmann M., Weber S. Mutations in CYP24A1 and idiopathic infantile hypercalcemia. // N Engl J Med. 2011. Т.365. С. 410–421. 173. Schottker B. et al. Strong associations of 25-hydroxyvitamin D concentrations with all-cause, cardiovascular, cancer, and respiratory disease mortality in a large cohort study. // Am. J. Clin. Nutr. 2013. Т. 97. № 4. С. 782–93. 174. Segaert S., Duvold L.B. Calcipotriol cream: a review of its use in the management of psoriasis. // J Dermatolog Treat. 2006. Т.17. С.327–337. 175. Selvaraj P. et al. Plasma 1,25 dihydroxy vitamin D3 level and expression of vitamin d receptor and cathelicidin in pulmonary tuberculosis. // J. Clin. Immunol. 2009. Т. 29. № 4. С. 470–8. 176. Selvaraj P., Chandra G., Jawahar M.S. Regulatory role of vitamin D receptor gene variants of Bsm I, Apa I, Taq I, and Fok I polymorphisms on macrophage phagocytosis and lymphoproliferative response to Mycobacterium tuberculosis antigen in pulmonary tuberculosis. // J Clin Immunol. 2004. Т.24. С.523–532. 177. Selvaraj P., Kurian S. M., Uma H. et al. Influence of non-MHC genes on lymphocyte response to Mycobacterium tuberculosis antigens and tuberculin reactive status in pulmonary tuberculosis // Indian J. Med. Res. – 2000. – Vol. 112. – P. 86-92. 178. Shah S. et al. The molecular basis of vitamin D receptor and beta-catenin crossregulation. // Mol. Cell. 2006. Т. 21. № 6. С. 799–809. 179. Shelburne SA, Hamill RJ, Rodriguez-Barradas MC, et al. Immune Reconstitution Inflammatory syndrome. Emergence of a unique syndrome during highly active antiretroviral therapy. Medicine 2002; 81: 213-27. 180. Singh A.K., Abhimanyu, Yadav A.B. HLA-DRB1*1501 and VDR polymorphisms and survival of Mycobacterium tuberculosis in human macrophages exposed to inhalable microparticles. // Pharmacogenomics. 2013. Т.14(5). С.531-40. 181. Speer G., Dworak O., Cseh K. et al. Vitamin D receptor gene BsmI polymorphism correlates with erbB-2/HER-2 expression in human rectal cancer. // Oncology. 2000. Т.58(3). С.242–7. 182. Sroga G.E., Karim L., Colon W. Biochemical characterization of major bone-matrix proteins using nanoscalesize bone samples and proteomics methodology. // Mol Cel Proteomics. 2011. Т.49. С. 238-245. 183. Strachan D.P. et al. Vegetarian diet as a risk factor for tuberculosis in immigrant south London Asians. // Thorax. 1995. Т. 50. № 2. С. 175–80. 184. Takahashi T., Morikawa K. Vitamin D receptor agonists: opportunities and challenges in drug discovery. // Curr Top Med Chem. 2006. Т.6. С.1303–1316. 185. Tanaka H., Seino Y. Direct action of 1,25-dihydroxyvitamin D on bone: VDRKO bone shows excessive bone formation in normal mineral condition. // J Steroid Biochem Mol Biol. 2004. Т.89–90. С.343–345. 186. Taylor J.A., Hirvonen A., Watson M. Association of prostate cancer with vitamin D receptor gene polymorphism. // Cancer Res. 1996. Т.56(18). С.4108–10. 187. Teng M., Wolf M., Lowrie E. et al: Survival of patients undergoing hemodialysis with paricalcitol or calcitriol. // N Engl J Med. 2003. Т.349. С.446-456. 188. Teng M., Wolf M., Ofsthun M.N. et al. Activated injectable vitamin D and hemodialysis survival: a historical cohort study. // J Am Soc Nephrol. 2005. Т.16. С.1115-1125. 189. Thacher T.D., Clarke B.L. Vitamin D insufficiency. // Mayo Clin. Proc. 2011. Т. 86. № 1. С. 50–60. 190. The Association between common vitamin D receptor gene variations and osteo- porosis: A participant-level meta-analysis / A.G. Uitterlinden [et al.] // Ann. Intern. Med. – 2006. – Vol. 145. – P. 255–264. 191. The polymorphism in the caudal-related homeodomain protein Cdx-2 binding element in the human vitamin D receptor gene / H. Arai [et al.] // J. Bone Miner. Res. – 2001. – Vol. 16, №7. – P. 1256–1264. 192. Tian X.Q. et al. Characterization of the translocation process of vitamin D3 from the skin into the circulation. // Endocrinology. 1994. Т. 135. № 2. С. 655–61. 193. Tripkovic L. et al. Comparison of vitamin D2 and vitamin D3 supplementation in raising serum 25-hydroxyvitamin D status: a systematic review and meta-analysis. // Am. J. Clin. Nutr. 2012. Т. 95. № 6. С. 1357–64. 194. Tsiaras W.G., Weinstock M.A. Factors influencing vitamin D status. // Acta Derm. Venereol. 2011. Т. 91. № 2. С. 115–24. 195. Uitterlinden S.G., Fang Y., van Meurs J.B. et al. Genetics and biology of vitamin D receptor polymorphisms. // Gene. 2004. Т. 338. С. 143-156. 196. Ustianowski A. et al. Prevalence and associations of vitamin D deficiency in foreign-born persons with tuberculosis in London. // J. Infect. 2005. Т. 50. № 5. С. 432–7. 197. Valdivielso J.M., Fernandez E. Vitamin D receptor polymorphisms and diseases. // Clin. Chim. Acta. 2006. Т. 371. № 1-2. С. 1–12. 198. Vezzoli G., Soldati L., Proverbio M.C. et al. Polymorphism of vitamin D receptor gene start codon in patients with calcium kidney stones. // J Nephrol. 2004. Т.15(2). С.158–64. 199. Vidyarani M. et al. 1, 25 Dihydroxyvitamin D3 modulated cytokine response in pulmonary tuberculosis. // Cytokine. 2007. Т. 40. № 2. С. 128–34. 200. Vitamin D-receptor gene polymorphisms and bone density in prepubertal American girls of Mexican descent / J. Sainz [et al.] // N. Engl. J. Med. – 1997. – Vol. 337, №2. – P. 77–82. 201. Wacker M., Holick M.F. Vitamin D - effects on skeletal and extraskeletal health and the need for supplementation. // Nutrients. 2013. Т. 5. № 1. С. 111–48. 202. Wang L., Manson J.E., Song Y. et al. Vitamin D and calcium supplementation in prevention of cardiovascular events. // Ann Intern Med. 2010. Т.152. С.315-323. 203. Wang T.J., Pencina M.J., Booth S.L. et al. Vitamin D deficiency and risk of cardiovascular disease. // Circulation. 2008. Т.117. С.503-511. 204. Wang Y., Sun Z. Klotho gene delivery prevents the progression of spontaneous hypertension and renal damage. // Hypertension. 2009. Т.54. С.810–817. 205. Weissen-Plenz G., Nitschke Y., Rutsch F. Mechanisms of arterial calcification: spotlight on the inhibitors. // Adv Clin Chem. 2008. Т.46. С.263–293. 206. Wejse C., Olesen R., Rabna P. et al. Serum 25-hydroxyvitamin D in a west African population of tuberculosis patients and unmatched healthy controls. // Am J Clin Nutr. 2007. Т.86. С.1376– 1383. 207. Wilbur A.K., Kubatko L.S., Hurtado A.M. Vitamin D receptor gene polymorphisms and susceptibility to M. tuberculosis in native Paraguayans. // Tuberculosis (Edinb). 2007. Т.87. С.329–337. 208. Wilkinson R. J., Lieweiyn M., Toossi Z. et al. Influence of vitamin D deficiency and vitamin D receptor polymorphisms on tuberculosis among Gujarati Asians in west London: a case-control study // Lancet. – 2000. – Vol. 355. – P. 618-621. 209. Williams B., Williams A.J., Anderson S.T. Vitamin D deficiency and insufficiency in children with tuberculosis. // Pediatr. Infect. Dis. J. 2008. Т. 27. № 10. С. 941–2. 210. Wolf M., Thadhani R. Vitamin D in patients with renal failure: a summary of observational mortality studies and steps moving forward. // J Steroid Biochem Mol Biol. 2007. Т.103. С.487–490. 211. World Health Organization. Global tuberculosis report 2013. WHO Report 2013. Geneva: World Health Organization; 2013. 212. Wu Y.J., Yang X., Wang X.X. Association of vitamin D receptor BsmI gene polymorphism with risk of tuberculosis: a meta-analysis of 15 studies. // PLoS One. 2013. Т.8(6). С.944. 213. Yang B.F., Han C.L. Meta-analysis of relationship of vitamin D receptor polymorphism and tuberculosis // China Trop. Med. 2006. Т. 6. С. 1347–1349. 214. Yang C.-Y. et al. The implication of vitamin D and autoimmunity: a comprehensive review. // Clin. Rev. Allergy Immunol. 2013. Т. 45. № 2. С. 217–26. 215. Ye W.Z., Reis A.F., Velho G. Identification of a novel Tru9 I polymorphism in the human vitamin D receptor gene. // J Hum Genet. 2000. Т.45(1). С. 56–7. 216. Yuan W. et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 suppresses renin gene transcription by blocking the activity of the cyclic AMP response element in the renin gene promoter. // J. Biol. Chem. 2007. Т. 282. № 41. С. 29821–30. 217. Zasloff M. Fighting infections with vitamin D. // Nat. Med. 2006. Т. 12. № 4. С. 388–90. 218. Zehnder D. et al. Extrarenal expression of 25-hydroxyvitamin d(3)-1 alpha-hydroxylase. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2001. Т. 86. № 2. С. 888–94. 219. Zella L.A., Kim S., Shevde N.K. Enhancers located in the vitamin D receptor gene mediate transcriptional autoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3. // J Steroid Biochem Mol Biol. 2007. Т.103. С.435–439. 220. Zerwekh J.E. Blood biomarkers of vitamin D status. // Am. J. Clin. Nutr. 2008. Т. 87. № 4. С. 1087S–91S. 221. Zhang J., Chalmers M.J., Stayrook K.R. et al. DNA binding alters coactivator interaction surfaces of the intact VDRRXR complex. // Nat Struct Mol Biol. 2011. Т.18. С.556–563. 222. Zhang R., Naughton D.P. Vitamin D in health and disease: current perspectives. // Nutr. J. 2010. Т. 9. № 1. С. 65. 223. Zhou C. et al. Calcium-independent and 1,25(OH)2D3-dependent regulation of the renin-angiotensin system in 1alpha-hydroxylase knockout mice. // Kidney Int. 2008. Т. 74. № 2. С. 170–9. 224. Колоколова О.В. Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири. Томск, 2005. 225. Москаленко М.В. Полиморфизм ряда генов метаболизма костной ткани и остеопороз у человека. Санкт-Петербург, 2011. 226. Грознова И.Е. Ассоциация полиморфизма гена IL-4Ra с развитием аллергических реакций по типу гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков. Москва, 2014. 227. Чикало А.О. Влияние полиморфизма генов IL4, CD40 и CD40L на развитие аллергических реакций по типу гиперчувствительности немедленного типа, вызванных применением бета-лактамных антибиотиков. Москва, 2013. 228. Беляева И. В., А. В. Николаев, Л. П. Чурилов, П. К. Яблонский. Кателицидины, витамин д и туберкулез. Журн.: ВЕСТНИК САНКТ

Глава 1. Обзор литературы 1.1 Общая характеристика проблемы исследования По последним оценкам Всемирной организации здравоохранения ежегодно продолжает регистрироваться более 8,6 млн новых случаев туберкулеза и 1,3 млн ежегодно умирает от туберкулеза [210]. И по этим же данным около одной трети населения мира инфицировано Mycobacterium tuberculosis, однако меньше чем у 10% из тех, кто инфицирован, разовьется туберкулез [32]. Такая статистика предполагает, что далеко не только бактериальные агенты определяют развитие заболевания. Помимо факторов риска окружающей среды и образа жизни, генетическая предрасположенность также вносит свой существенный вклад [92; 165]. Известно, что витамин D модулирует активность моноцитов и макрофагов в организме и играет важную роль во врожденном иммунитете к некоторым инфекциям, в том числе и к M. tuberculosis. В недавно проведенном мета-анализе было показано, что низкий уровень витамина D коррелирует с высоким риском развития туберкулеза [111]. Витамин D в большинстве случаев оказывает свое влияние через рецептор витамина D (РВD), ядерный гормональный рецептор. В связи с этим полиморфизм гена VDR может напрямую влиять на активность РВD и изменять низ лежащие витамин D-опосредованные процессы, поэтому данные полиморфизмы были определены как потенциальные кандидаты в маркеры риска для различных клинических случаев, связанных с нарушением метаболизма витамина D [151]. Так в 2005 году Льюис с соавторами провели мета-анализ, в котором оценили корреляцию легочной формы туберкулеза с наличием полиморфизмов гена VDR FokI (rs2228570) и TaqI (rs731236) [92], а в 2006 году Ян и Хань обобщили известные данные по полиморфизму FokI [165]. Но к сожалению, ни в одном из указанных исследований не было найдено убедительной взаимосвязи между изученными полиморфизмами гена VDR и легочной формой туберкулеза. Тем не менее, стоит учесть, что только шесть исследований были обобщены для каждого из полиморфизмов, которые были рассмотрены в двух мета-анализах, эти результаты не обладают необходимой научной мощностью, чтобы обнаружить значимый вклад в исследование механизмов восприимчивости к туберкулезу того или иного генотипа, аналогичные работы были проведены и для мутаций ApaI (rs7975232) и BsmI (rs1544410) [49]. Кроме того, небольшое количество включенных исследований также ограничило стратифицированный анализ, чтобы изучить происхождение имеющихся несоответствий. В последние несколько лет все больше исследований было посвящено изучению воздействия полиморфизмов VDR на восприимчивость к туберкулезу в разных популяциях. ? Глава 2. Материалы и методы исследования 2.1. Формирование групп исследования Общее количество генетически обследованных составляет 200 человек, средний возраст составил 36,72±13,2 лет. Для проведения исследования было сформировано две группы. В основную группу включили 106 пациентов в анамнезе которых присутствует заболевание туберкулез легких. Критерии включения: казахская национальность, возраст – старше 18 лет и выше, пол – мужчины и женщины, заболевание – туберкулез легких, здоровые лица. Критерии не включения: иная национальная принадлежность (кроме казахов). В контрольную группу было включено 94 человек условно здоровые люди, в анамнезе отсутствовал туберкулез легких. Критерии включения: казахская национальность, возраст – старше 18 лет и выше, пол – мужчины и женщины. Критерии не включения: иная национальная принадлежность (кроме казахов). Принадлежность этноса определяли путем их самоидентификации и с их слов по самоидентификации родителей. Взятие биоматериала было проведено согласно нормам биоэтики с подписанием информированного согласия на участие в генетическом исследовании участниками. Проведение исследования было одобрено Локальным Комитетом по этике Первого Московского государственного Медицинского Университета имени И.М. Сеченова от 15.07.2015 года (прокол №07-15). Генетическое исследование проводили методами ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция с последующим изучением полиморфизма длин рестрикционных фрагментов) с использованием рестриктаз FokI, BsmI, ApaI, TaqI, Cdx2 и метод аллель-специфичной ПЦР (Cdx2). Забор венозной крови для проведения генетического исследования производился натощак утром в специальные пробирки с реактивом – ЭДТА, объем крови составлял 5 мл. На каждой пробирке был указан только идентифицирующий номер участника. Все данные об участнике записывались в журнал «Учет испытуемых», где указывались код, фамилия, имя, отчество, дата рождения, пол, вес, рост, диагноз (при наличии). Забор крови проводился в ОА «Научном центре противоинфекционных препаратов» города Алматы (Казахстан). После забора крови образцы тщательно перемешивались с реактивом во избежание сгустков крови. Образцы крови замораживались при температуре -200С, транспортировались из города Алматы (Казахстан) в город Москва (Россия) в специализированном герметичном контейнере с хладоэлементами. Генетический анализ клинического материала проводили в отделе Персонализированной медицины и клинической фармакогенетики Центра клинической фармакологии научного Центра экспертизы средств медицинского применения Минздрава России. 2.2. Определение полиморфизмов гена VDR Полиморфизмы гена VDR определяли с помощью метода ПЦР¬¬¬ – ПДРФ. Однако при генотипировании по полиморфизму Cdx2 возникли определенные сложности, связанные с неспецифической рестрикцией, возникающей при длительном инкубировании продукта ПЦР с рестриктазой Bst4CI. Опасения в дальнейшем успехе этого метода вызвало то, что целый ряд авторов, применявших метод ПЦР¬¬¬ – ПДРФ для выявления многих других полиморфизмов, неизменно использовали альтернативные методы именно для изучения полиморфизма Cdx2. Однако альтернативная методика, широко использующаяся в научной среде для этого полиморфизма (4-х праймерная аллель-специфическая ПЦР) оказалась трудновоспроизводимой. Как бы там ни было, в дальнейшем нам удалось наладить обе методики генотипирования гена VDR по Cdx2, и полученные благодаря им, результаты совпали на 100%. В методической части настоящей работы мы приводим описание обоих использованных метода определения генотипов Cdx2. 2.2.1 Выделение геномной ДНК ДНК выделяли из лейкоцитов цельной крови с помощью комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала «АмплиПрайм ДНК-сорб-В», Москва. Принцип метода. Клинический материал обрабатывался лизирующим раствором в присутствие частиц силики – сорбента. В результате происходило деструкция клеточных мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов и высвобождение ДНК. Растворенная ДНК в присутствие лизирующего раствора связывалась с частицами сорбента, в то время как другие компоненты лизированного клинического материала оставались в растворе и удалялись при осаждении сорбента центрифугированием и последующей отмывкой. При добавлении раствора для элюции ДНК к сорбенту происходил переход ДНК с поверхности силики в раствор, который отделялся от частичек сорбента центрифугированием. В результате указанной процедуры получался высокоочищенный препарат ДНК, свободный от ингибиторов реакции амплификации, что обеспечивало высокую аналитическую чувствительность ПЦР - исследования. В одноразовые стерильные полипропиленовые пробирки добавляли в пробирки по 300 мкл лизирующего раствора и по 100 мкл клинического образца. В качестве отрицательного контроля использовалась бидистиллированная вода 100 мкл. Пробирки плотно закрывались, содержимое тщательно перемешивалось на вортексе. Проводили инкубацию полученной смеси в течение 5 мин при 65°С (после чего скидывали конденсат). Затем центрифугировали пробирки при 5 тыс. об/мин в течение 5 секунд. После растворения пробы ресуспендировали сорбент универсальный на вортексе. Далее добавляли в пробирки по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального. Затем снова перемешивали на вортексе в течение 2 минут. Повторно центрифугировали пробирки при 5 тыс. об/мин в течение 30 секунд. Удаляли, насадочную жидкость не касаясь сорбента. Добавляли в пробирки по 300 мкл отмывочного раствора 1, далее помещали на вортекс для перемешивания до полного ресуспендирования сорбента. Повторно центрифугировали пробирки при 5 тыс. об/мин в течение 30 секунд. Удаляли, насадочную жидкость не касаясь сорбента. Добавляли в пробирки по 300 мкл отмывочного раствора 2, далее помещали на вортекс для перемешивания до полного ресуспендирования сорбента. Центрифугировали пробирки при 10 тыс об/минв течение 30 секунд. Удаляли, насадочную жидкость не касаясь сорбента. Повторно добавляли в пробирки по 300 мкл отмывочного раствора 2, далее помещали на вортекс для перемешивания до полного ресуспендирования сорбента. Центрифугировали пробирки при 10 тыс. об/мин в течение 30 секунд. Удаляли, насадочную жидкость не касаясь сорбента. Помещали пробирки с открытой крышкой в термостат с температурой 65°С на 10 минут для подсушивания сорбента со связанной ДНК, далее в пробирки добавляли по 50 мкл ТЕ-буфера (трис-ЭДТА) для элюции ДНК. Далее повторно центрифугировали пробирки при 12 тыс. об/мин в течение 1 минуты. Надосадочная жидкость содержала очищенную ДНК. Образцы ДНК хранили при -20°С. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, так называемый ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP analysis) включает следующие этапы: выделение геномной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, элекрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК и идентификацию фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рестрикции. 2.2.2 Амплификация (проведение ПЦР) Подготовка рабочей амплификационной смеси При приготовлении рабочей амплификационной смеси каждый компонент добавляется отдельным наконечником с аэрозольными барьерами (фильтрами), в том числе и для внесения в пробирки препарата ДНК. Рабочие смеси готовились непосредственно перед амплификацией. После внесения образца пробирки сразу помещались в амплификатор. За 20–30 минут до приготовления реакционной ПЦР-смеси извлекались все, кроме Taq ДНК-полимеразы, реагенты и исследуемые образцы ДНК из морозильника, размораживали их содержимое на льду и встряхивали на вортексе в течение 5 секунд. Приготовили и пронумеровали ПЦР-пробирки для амплификации вместимостью 0,5 мл в соответствии с количеством анализируемых проб плюс отрицательный контроль. Определение генотипов полиморфизмов: FokI (rs10735810), BsmI (rs1544410), ApaI (rs7975232), TaqI (rs731236) и Cdx2 (rs11568820) гена VDR производилось с помощью метода ПЦР-ПДРФ. В таблице 4 приведены праймеры для ПЦР. Таблица 4 Структура праймеров для определения полиморфизмов гена VDR Название полиморфизма Размер ПЦР-продукта Нуклеотидная последовательность праймеров VDR-FokI 265 п.н. F5’-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGGCTCT-3’ R5’-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3’ VDR-BsmI 473 п.н. F5’-GCATCGTCTCCCCAGGTATG-3’ R5’-ACCAGCGGAAGAGGTCAAG-3’ VDR-ApaI 501 п.н. F5’-CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3’ R5’-CACTTCGAGCACAAGGGGCGTTAGC-3’ VDR-TaqI 501 п.н. F5’-CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3’ R5’-CACTTCGAGCACAAGGGGCGTTAGC-3’ VDR-Cdx2 357 п.н. F5’-CTGTATTTTGGGTCACAACCCATT-3’ R5’-TCAAAATTTTAACTGCAACCCA-3’ ПЦР всех 5 полиморфизмов осуществлялась сходным образом, различия касались только концентрации хлорида магния и температуры отжига праймеров. Реакционная смесь имела следующий состав для пяти полиморфизмов: • 1,3 мкл буфера для проведения ПЦР; • 1 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (по 2,5 мМ каждого) (ЗАО «Синтол», Россия); • по 0,2 мкл каждого праймера из пары (по 3-4 пмоль); • 0,5 мкл SynTaq-полимеразы (Taq-полимераза, производство «Синтол», Россия) в количестве 2,5 единицы активности на пробу; • деионизированная вода из расчета 12 мкл конечного объема на одну пробу. Конечная концентрация магния хлорида составляла: • для FokI и TaqI/ApaI 1 мМ; • для BsmI и Cdx2 составляет 2 мМ. Готовая смесь вносилась в ПЦР-пробирки (объемом 0,5 мл) по 12 мкл. Добавлялось по 2 капли минерального масла. В каждую пробирку вносилась геномная ДНК в объеме 1 мкл. В пробирку с отрицательным контролем вместо ДНК вносилась дионизированная вода. Программа проведения ПЦР для вышеуказанных полиморфизмов была единая и включала следующие этапы: 1. первоначальная денатурация ДНК при 95°С в течение 1 минуты; 2. 35 циклов синтеза ДНК состоящего из этапов денатурации ДНК при 95°С в течение 10 секунд, отжига праймеров в течение 40 секунд, синтеза ДНК при 72°С в течение 10 секунд; 3. дополнительная элонгация при 72 ° С в течение 7 минут; 4. хранение продукта ПЦР при 10 ° С; 5. температура отжига составляла для полиморфизмов для FokI и Cdx2 55°С, для полиморфизмов BsmI, TaqI/ApaI – 60°С. 2.2.3 Рестрикционный анализ После этапа амплификации был проведен рестрикционный анализ. 1. Реакция рестрикции для определения FokI полиморфизма В одной пробирке готовилась рестрикционная смесь, содержащая: • дионизированную воду до общего объема 9,5 мкл на пробу; • буфер Yellow 1 мкл на пробу 10х раствора; • эндонуклеаза рестрикции FokI в количестве 1 единица активности на пробу; Смесь разливали в пробирки по числу проб по 9, 5 мкл, добавлялось по 2 капли минерального масла и отдельными наконечниками под масло вносились пробы, представляющие собой амплифицированую ДНК в объеме 0,5 мкл. Суммарный объем пробы составлял 10 мкл. Рестрикция проводилась на твердотельном термостате при температуре 370С в течение 4 часов. Анализ полученных рестрикционных фрагментов осуществлялся при помощи электрофореза в 11% полиакриламидном геле, при напряжении 60 вольт в течение 1 часа. В один из карманов геля вносился маркер молекулярного веса ДНК. Гель окрашивался погружением бромистого этидия. Бромистый этидий, необходимый для окрашивания молекул ДНК, добавляли в гель при его приготовлении (4,5 мкл 0,5 мкг/мл раствора бромистого этидия на 60 мл агарозного геля). Визуализировали продукты амплификации на трансиллюминаторе TCХ-15 M производства «Vilber Lourmat», Франция в ультрафиолетовом свете при длине волны 312 нм. Фрагменты амплифицированной ДНК и рестрикционные фрагменты проявляются в виде светящихся оранжево-красных полос при УФ-облучении. Полиморфизм оценивают согласно картине, полученной на электрофореграммах. В присутствии сайта рестрикции FokI в обоих аллелях (генотип Т/Т) образуется 2 фрагмента ДНК с размером – 196 п.н. и 69 п.н., в то время как отсутствие сайта рестрикции в обоих аллелях (генотип С/С) дает один фрагмент 265 п.н. При наличии сайта рестрикции лишь в одном из двух аллелей (гетерозиготный генотип Т/С) образуются фрагменты 265 п.н., 196 п.н. и 69 п.н. 2. Реакция рестрикции для определения BsmI полиморфизма Для BsmI полиморфизма праймеры подбирались программой BLAST в онлайн режиме. В одной пробирке готовилась рестрикционная смесь, содержащая: • дионизированную воду до общего объема 9 мкл на пробу; • буфер Orange 1 мкл на пробу 10х раствора; • эндонуклеаза рестрикции PctI в количестве 10 единиц активности на пробу; Смесь помещалась в пробирки в соответствии с числом проб по 9 мкл, добавлялось по 2 капли минерального масла и отдельными наконечниками под масло вносились пробы, представляющие собой амплифицированую ДНК в объеме 1 мкл. Суммарный объем пробы составлял 10 мкл. Рестрикция проводилась на твердотельном термостате при температуре 370С в течение 4 часов. Анализ полученных рестрикционных фрагментов осуществлялся при помощи электрофореза в 11% полиакриламидном геле, при напряжении 60 вольт в течение 2 часа. В один из карманов геля вносился маркер молекулярного веса ДНК. Гель окрашивался погружением бромистого этидия. Окрашивание и визуализация геля проводилась, так как описано выше. В присутствии сайта рестрикции BsmI в обоих аллелях (генотип G/G) образуется 2 фрагмента ДНК с размером – 296 п.н. и 178 п.н., в то время как отсутствие сайта рестрикции в обоих аллелях (генотип A/A) дает один фрагмент 474 п.н. При наличии сайта рестрикции лишь в одном из двух аллелей (гетерозиготный генотип G/A) образуются фрагменты 474 п.н., 296 п.н. и 178 п.н. 3. Реакция рестрикции для определения ApaI полиморфизма В одной пробирке готовилась рестрикционная смесь, содержащая: • дионизированную воду до общего объема 9,2 мкл на пробу; • буфер Yellow 1 мкл на пробу 10х раствора; • бычий сывороточный альбумин до конечной концентрации 0,1 мг/мл; • эндонуклеаза рестрикции ApaI в количестве 5 единиц активности на пробу; Смесь помещалась в пробирки по числу проб по 9, 2 мкл, добавлялось по 2 капли минерального масла и отдельными наконечниками под масло вносились пробы, представляющие собой амплифицированую ДНК в объеме 0,8 мкл. Суммарный объем пробы составлял 10 мкл. Рестрикция проводилась на твердотельном термостате при температуре 370С в течение 3 часов. Анализ полученных рестрикционных фрагментов осуществлялся при помощи электрофореза в 11% полиакриламидном геле, при напряжении 60 вольт в течение 1 час 40 минут. В один из карманов геля вносился маркер молекулярного веса ДНК. Гель окрашивался погружением бромистого этидия. Окрашивание и визуализация геля проводилась, так как описано выше. В присутствии сайта рестрикции ApaI в обоих аллелях (генотип C/C) образуется 2 фрагмента ДНК с размером – 284 п.н. и 217 п.н., в то время как отсутствие сайта рестрикции в обоих аллелях (генотип А/А) дает один фрагмент 284 п.н. При наличии сайта рестрикции лишь в одном из двух аллелей (гетерозиготный генотип C/A) образуются фрагменты 501 п.н., 284 п.н. и 217 п.н. 4. Реакция рестрикции для определения TaqI полиморфизма В одной пробирке готовилась рестрикционная смесь, содержащая: • дионизированную воду до общего объема 9,5 мкл на пробу; • буфер Yellow 1 мкл на пробу 10х раствора; • бычий сывороточный альбумин до конечной концентрации 0,1 мг/мл; • эндонуклеаза рестрикции TaqI в количестве 1,5 единиц активности на пробу; Смесь помещалась в пробирки по числу проб по 9,5 мкл, добавлялось по 2 капли минерального масла и отдельными наконечниками под масло вносились пробы, представляющие собой амплифицированую ДНК в объеме 0,5 мкл. Суммарный объем пробы составлял 10 мкл. Рестрикция проводилась на твердотельном термостате при температуре 650С в течение 3 часов. Анализ полученных рестрикционных фрагментов осуществлялся при помощи электрофореза в 11% полиакриламидном геле, при напряжении 60 вольт в течение 1 час 40 минут. В один из карманов геля вносился маркер молекулярного веса ДНК. Гель окрашивался погружением бромистого этидия. Окрашивание и визуализация геля проводилась, как описано выше. В присутствии сайта рестрикции TaqI в обоих аллелях (генотип С/С) образуется 3 фрагмента ДНК с размером – 293 п.н., 201 п.н. и 7 п.н., в то время как отсутствие сайта рестрикции в обоих аллелях (генотип T/T) дает фрагменты 494 п.н. и 7 п.н. При наличии сайта рестрикции лишь в одном из двух аллелей (гетерозиготный генотип T/С) образуют фрагменты 494 п.н., 293 п.н., 201 п.н. и 7 п.н [226, 227]. 5. Реакция рестрикции для определения Cdx2 полиморфизма В одной пробирке готовилась рестрикционная смесь, содержащая: • дионизированную воду до общего объема 9,4 мкл на пробу; • буфер Yellow 1 мкл на пробу 10х раствора; • эндонуклеаза рестрикции Bst4CI в количестве 4 единиц активности на пробу; Смесь помещалась в пробирки в соответствии с числом проб по 9,4 мкл, добавлялось по 2 капли минерального масла и отдельными наконечниками под масло вносились пробы, представляющие собой амплифицированую ДНК в объеме 0,6 мкл. Суммарный объем пробы составлял 10 мкл. Рестрикция проводилась на твердотельном термостате при температуре 650С в течение 1 часа. Анализ полученных рестрикционных фрагментов осуществлялся при помощи электрофореза в 11% полиакриламидном геле, при напряжении 60 вольт в течение 3 часов. В один из карманов геля вносился маркер молекулярного веса ДНК. Гель окрашивался погружением бромистого этидия. Окрашивание и визуализация геля проводилась, так как описано выше. В присутствии сайта рестрикции Cdx2 в обоих аллелях (генотип G/G) образуется 2 фрагмента ДНК с размером – 314 п.н. и 43 п.н., в то время как отсутствие сайта рестрикции в обоих аллелях (генотип A/A) дает один фрагмент 357 п.н. При наличии сайта рестрикции лишь в одном из двух аллелей (гетерозиготный генотип G/A) образуются фрагменты 357 п.н., 314 п.н. и 43 п.н. 2.2.4 Разделение продуктов реакции амплификации и рестрикции методом вертикального гель-электрофореза 1. Залить в аппарат для электрофореза ТБЕ буфер, приготовленный на дистиллированной воде разбавлением 10хТБЕ в 10 раз (рН = 8,3): 70 мл 10хТБЕ добавить к 630 мл дистиллированной воды. 2. Для приготовления 2% геля к 3,0 г агарозы добавить 15 мл 10х ТБЕ буфера и 132 мл дистиллированной воды. 3. Приготовленную агарозную смесь расплавить в СВЧ-печи до однородности, что производиться в конической колбе из термостойкого стекла. Добавить к 150 мл расплавленной агарозы 15 мкл 1% раствора бромистого этидия. Перемешать до однородной окраски, избегая аэрации раствора. 4. Охладить расплавленную агарозу до температуры 50–60?С и залить в кювету для заливки геля. Для получения в агарозном геле карманов для нанесения образцов нужно предварительно перед заливкой агарозы установить в кювету гребенку (ее зубцы не должны доставать до дна приметно 1 мм), при этом толщина гребенки и толщина геля должны обеспечить объем карманов не менее 20–25 мкл. После застывания агарозы осторожно вынуть гребенку из геля и перенести кювету с гелем в камеру для проведения электрофореза. 5. Подготовить к электрофорезу образцы ПЦР-амплифицированной ДНК, для чего смешать их с буфером для нанесения (5:1, О/О). 6. Нанести в карманы геля по 15–20 мкл амплифицированной ДНК и продукта рестрикционного анализа. Для контроля длин полученных фрагментов использовать коммерческие маркеры длин ДНК при каждом электрофорезе наряду с образцами. 7. Подключить электрофоретическую камеру к источнику питания и задать напряжение электрического поля 10 В/см геля. Провести электрофоретическое разделение продуктов в направлении от катода (–) к аноду (+). 2.2.5 Детекция продуктов амплификации Визуализация результатов электрофореза Контроль электрофоретического разделения осуществляется визуально по движению полос красителей. Оптимальное время разгонки — 90 мин при напряжении электрического поля 6 В/см геля. Вынуть гель из формы и перенести его на стекло УФ-трансиллюминатора. С гелем агарозы следует работать в перчатках, так как бромистый этидий является сильным мутагеном. Включить трансиллюминатор и проанализировать результаты анализа (визуальную детекцию проводить только с защитным экраном либо в очках, не пропускающих УФ-излучение). Фрагменты амплифицированной ДНК и рестрикционные фрагменты проявляются в виде светящихся оранжево-красных полос при УФ-облучении. Полиморфизм оценивают согласно картине, полученной на электрофореграммах. Длины фрагментов устанавливают относительно набора определенных фрагментов ДНК известной длины. 2.2.6 Методика определения полиморфизма Cdx2 гена VDR с помощью аллель-специфичной ПЦР За основу нашей методики мы взяли последовательность 4 праймеров использующихся во множественной аллель-специфичной ПЦР и встречающихся во многих исследовательских работах. Последовательность используемых праймеров приведена в таблице 5. Химический синтез олигонуклеотидов, использованных в качестве праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР), выполнен научно-производственной фирмой «Литех», Россия. Таблица 5 Праймеры для идентификации полиморфизма Cdx2 (rs11568820) rs11568820 Последовательность праймеров Размер амплифицируемого фрагмента G-аллель F1: 5’ -AGGATAGAGAAAATAATAGAAAACATT-3’ R1: 5’ -AACCCATAATAAGAAATAAGTTTTTAC-3’ 110 пар нуклеотидов А-аллель F2: 5’ -TCCTGAGTAAACTAGGTCACAA-3’ R2: 5’ -ACGTTAAGTTCAGAAAGATTAATTC-3’ 235 пар нуклеотидов При воспроизведении методики возникли проблемы, преодолеть которые удалось после разделения реакции на 2 пробирки (в одной пробирке аллель-специфичная реакция на аллель G, а в другой пробирке аллель-специфичная реакция на аллель А). ПЦР проводилась в объеме 10 мкл. Реакционная смесь содержала: • 1 мкл буфера для проведения ПЦР; • 1 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (по 2,5 мМ каждого) (ЗАО «Синтол», Россия); • 0,5 мкл магния хлорида 25 мМ (конечная концентрация магния 1,25 мМ) (ЗАО «Синтол», Россия); • по 0,1 мкл каждого праймера из пары (по 3-4 пмоль); • 0,3 мкл Taq-полимеразы для аллель-специфичной ПЦР (1,5 единицы активности); • 1 мкл геномной ДНК; • деионизированную воду до 10 мкл. Программа проведения ПЦР включала следующие этапы: 1. первоначальная денатурация ДНК при 94°С в течение 1 минуты; 2. 28 циклов синтеза ДНК, состоящих из этапов денатурации ДНК при 94°С в течение 45 секунд, отжига праймеров при 56°С в течение 45 секунд, синтеза ДНК при 72°С в течение 45 секунд. 3. дополнительная элонгация при 72°С в течение 5 минут. 4. хранение продукта ПЦР при 15°С. Визуализацию продуктов амплификации проводили методом вертикального электрофореза в 3% агарозном геле на основе 1% ТАЕ с добавлением бромистого этидия. Фрагменты ДНК после амплификации наносили в лунки агарозного геля, предварительно добавив в образцы краситель (бромфеноловый синий) с глицерином.