Генетическая структура популяций сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica Du Tour) на восточном макросклоне Кузнецкого Алатау

ВВЕДЕНИЕ 5 1 ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА PINUS L. 8 1.1 Морфологическая характеристика 8 1.2 Систематика рода Pinus 9 1.3 Экология и ареал обитания 10 1.5 Краткая характеристика сосны кедровой сибирской Pinus sibirica Du Tour 12 2 ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ В ПОПУЛЯЦИЯХ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ 16 2.1 Основные понятия и критерии оценки молекулярного маркера 17 2.2 Основные классы молекулярных маркеров 18 3 МИКРОСАТЕЛЛИТНЫЕ МАРКЕРЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ РАСТЕНИЙ 20 3.1 Определение и свойства 20 3.2 Микросателлиты в генетике растений 21 4 МЕТОДИКА РАЗРАБОТКИ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ И ПРОВЕДЕНИЕ SSR АНАЛИЗА 23 4.1 NGS-технологии в разработке микросателлитных маркеров 24 4.2 Идентификация тандемных повторов и подбор праймеров для микросателлитных локусов 25 4.3 Оптимизация условий ПЦР и применение гель-электрофореза для идентификации SSR локусов 25 5 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 27 5.1 Отбор полиморфных маркеров 27 5.2 Отработка полиморфных маркеров на нескольких популяциях P.sibirica 30 5.3 Оценка показателей генетического разнообразия 34 6 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 36 6.1 Отбор полиморфных маркеров 36 6.2 Оценка показателей внутрипопуляционного генетического разнообразия вида P.sibirica 38 6.3 Популяционная структура 43 ВЫВОДЫ 49 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 50 ?

1. Asif, M. High resolution metaphor agarose gel electrophoresis for genotyping with microsatellite markers / M. Asif, M. Rahman, J. Mirza // Pak. J. Agri. Sci. - 2008. - V. 45. - I. 1. - P. 75-79. 2. Benson, G. Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences / G. Benson // Nucleic Acids Res. - 1999. - V. 27. - P. 573–580. 3. Chakraborty, R. Apparent heterozygote deficiencies observed in DNA typing data and their implications in forensic applications / R.Chakraborty //Annals of human genetics. – 1992. – Т. 56. – №. 1. – С. 45-57. 4. da Maia, L. C. SSR locator: tool for simple sequence repeat discovery integrated with primer design and PCR simulation / L. C. da Maia, et al. // Int. J. Plant Genomics. — 2008. —P. 412-696. 5. Delmas, C.E. Isolation and characterization of microsatellite loci in Rhododendron ferrugineum (Ericaceae) using pyrosequencing technology / C.E. Delmas, E. Lhuillier, A. Pornon, N. Escaravage // American Journal of Botany. - 2011 - V. 98. - I 5. - P. 120-2. 6. Devey, M.E. A genetic linkage map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD, and microsatellite markers /M.E. Devey, J.C. Bell, D.N. Smith et al. //Theoretical and Applied Genetics. – 1996. – Т. 92. – №. 6. – С. 673-679. 7. Duran, C. Predicting polymorphic EST-SSRs in silico / C. Duran, R. Singhania, H. Raman et al.// Mol. Ecol. Resour. - 2013. - V.13. - P. 538–545. 8. Farjon, A. Pines: drawings and descriptions of the genus Pinus / A. Farjon// Brill, 2018. – 235 p. 9. Gernandt, D.S. Phylogeny and classification of Pinus /D.S. Gernandt, G.G. Lopez, S.O. Garcia //Taxon. – 2005. – Т. 54. – №. 1. – С. 29-42. 10. Glenn, T.C Isolating microsatellite DNA loci /T.C. Glenn, N.A. Schable //Methods in enzymology. – Academic Press, 2005. – Т. 395. – С. 202-222. 11. Guries, R.P. Genetic diversity and population structure in pitch pine (Pinus rigida Mill.) /R.P. Guries, F.T. Ledig//Evolution. – 1982. – Т. 36. – №. 2. – С. 387-402. 12. Holmen, J. Cross-species amplification of 36 cyprinid microsatellite loci in Phoxinus phoxinus (L.) and Scardinius erythrophthalmus (L.) / J. Holmen, L.A. Vollestad, K.S. Jakobsen, C.R. Primmer // BMC Res Notes. - 2009. - V. 2. - P. 248. 13. Jewell, E. SSR primer and SSR taxonomy tree: Biome SSR discovery / E. Jewell, A. Robinson, D. Savage // Nucl. Acids Res. - 2006. - V. 34. - P. 656–659. 14. Kalia, R.K. Microsatellite markers: an overview of the recent progress in plants / R.K. Kalia, M.K. Rai, S. Kalia et al. // Euphytica.- 2011. - V. 177. - P.309-334. 15. Karam, M. J. Genomic exploration and molecular marker development in a large and complex conifer genome using RADseq and mRNAseq / M.J. Karam, F. Lefevre, M.B. Dagher?Kharrat et. al. // Mol Ecol Resour. - 2015 - V.15. - I. 3. - P. 601-12. 16. Katti, M. V. Differential distribution of simple sequence repeats in eukaryotic genome sequences / M.V. Katti, P.K. Ranjekar, V.S. Gupta // Mol Biol Evol. - 2001. - V. 18: - P. 1161-1167. 17. Kaur, S. Simple Sequence Repeat Markers in Genetic Divergence and Marker-Assisted Selection of Rice Cultivars: A Review / S. Kaur, P.S. Panesar, M.B. Bera, V. Kaur // Critical Reviews in Food Science and Nutrition. - 2015. - V. 55. -I. 1. - P. 41-49. 18. Kofler, R. SciRoKo: a new tool for whole genome microsatellite search and investigation / R. Kofler, C. Schlotterer, T. Lelley // Bioinformatics. - 2007. - V. 23. - P. 1683–1685. 19. Linnaeus C. Species Plantarum, exhibentes plantas rite cognitas, ad genera relatas, cum differentiis specificis, nominibus trivialibus, synonymis selectis, locis natalibus, secundum systema sexuale digestas. Tomus II. - Holmiae: Impensis Laurentii Salvii, 1753. 20. Mantel, N. The detection of disease clustering and a generalized regression approach / N. Mantel //Cancer research. – 1967. – Т. 27. – №. 2 Part 1. – С. 209-220. 21. Nei, M. Genetic Distance between Populations / M. Nei // Am. Nat. - 1972. - V. 106. - P. 283–291. 22. Ng, K.K.S. Forensic timber identification: a case study of a CITES listed species, Gonystylus bancanus (Thymelaeaceae) / K.K.S. Ng, S.L. Lee, L.H. Tnah, Z. Nurul-Farhanah et al. // Forensic Sci Int Genet. - 2016. - V. 23. - P. 197-209. 23. Nobis, M.P Latitudinal variation in morphological traits of the genus Pinus and its relation to environmental and phylogenetic signals / M.P. Nobis, С Traiser, A. Roth-Nebelsick //Plant Ecology & Diversity. – 2012. – Т. 5. – №. 1. – С. 1-11. 24. Peakall, R. GenAlEx V6: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research / R. Peakall, P.E. Smouse // Mol. Ecology Notes. - 2006. - V. 6. № 1. P. 288–295. 25. Price, R.A. Phylogeny and systematics of Pinus /R.A. Price, A. Liston, S.H. Strauss //Ecology and biogeography of Pinus. – 1998. – С. 49-68. 26. Rassman, K. Isolation of simple sequence loci for use in polymerase chain reaction-based DNA fingerprinting / K. Rassman, C. Schlotterer, D. Tautz // Electrophoresis. - 1991. - V. 12. - P. 113–118. 27. Rose, О. A threshold size for microsatellite expansion / O. Rose, D. Falush // Mol Biol Evol. - 1998. - V. 15. - P. 613-615. 28. Salzer, K. Isolation and characterization of polymorphic nuclear microsatellite loci in Pinus cembra L / K. Salzer, F. Sebastiani, F. Gugerli, A. Buonamici //Molecular ecology resources. – 2009. – Т. 9. – №. 3. – С. 858-861. 29. Senan, S. Methods for development of microsatellite markers: an overview / S. Senan, D. Kizhakayil, B. Sasikumar, T. E. Sheeja. // Not Sci Biol. - 2014. -V. 6. - P.1-13. 30. StatSoft Inc., STATISTICA Data Analysis Software System, Version 8.0, www.statsoft.com. 2007. 31. Teoh, S.B. Nuclear DNA amounts in populations of Picea and Pinus species / S.B. Teoh, H. Rees //Heredity. – 1976. – Т. 36. – №. 1. – P. 123. 32. Tereba, A. Analysis of DNA profiles of ash (Fraxinus excelsior L.) to provide evidence of illegal logging / A. Tereba, S.Woodward, A. Konecka, M. Borys // Wood Science and Technology. - 2017. - V. 51. - I. 6. - P. 1377–1387. 33. Thiel, T. Exploiting EST databases for the development and characterization of gene-derived SSR-markers in barley (Hordeum vulgare L.) / T. Thiel, W. Michalek, R. Varshney, A. Graner // Theor. Appl. Genet. - 2003. - V. 106. - P. 411–422. 34. Van Oosterhout, C. MICRO-CHECKER: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite date / C. Van Oosterhout, W.F. Hutchinson, D.P.M. Wills, P. Shipley // Mol. Ecology Notes. 2004. - № 4. P. 353–538. 35. Varshney, R.K. Exciting journey of 10 years from genomes to fields and markets: Some success stories of genomics-assisted breeding in chickpea, pigeonpea and groundnut / R.K. Varshney // Plant Sci. - 2016. - V. 242. - P. 98-107. 36. Wang, X. GMATo: a novel tool for the identification and analysis of microsatellites in large genomes / X. Wang, P. Lu, Z. Luo // Bioinformation. - 2013. -V. 9. - P. 541–544. 37. Wang, X.R. Molecular Markers in Population Genetics of Forest Trees / X.R. Wang, A.E. Szmidt // Scandinavian Journal of Forest Research. - 2001. - V. 16. - № 3. - P. 199-220. 38. Wheeler, G.L. A review of the prevalence, utility, and caveats of using chloroplast simple sequence repeats for studies of plant biology / G.L. Wheeler, H.E. Dorman, A. Buchanan et al // Applications in Plant Sciences. - 2014. - V. 2. - I. 12. 39. Wheeler, N.C. Biosystematics of the genus Pinus, subsection Contortae / N.C. Wheeler, R.P. Guries, D.M. O’Malley //Biochemical Systematics and Ecology. – 1983. – Т. 11. – №. 4. – С. 333-340. 40. Xu, X. The direction of microsatellite mutations is dependent upon allele length / X. Xu, M. Peng, Z. Fang // Nat Genet. - 2000. - V. 24: - P. 396–399. 41. Zalapa, J.E. Using next-generation sequencing approaches to isolate simple sequence repeat (SSR) loci in the plant sciences/ J.E. Zalapa, H. Cuevas, H. Zhu et al. // American Journal of Botany. - 2012. - V. 99. - I. 2. - P. 193–208. 42. Аболин, Р.И. Болотные формы Pinus silvestris L ./Р.И. Аболин //Тр. Бот. музея АН. – 1915. – №. 14. – С. 62-84. 43. Авров, Ф.Д. Генетический обмен между насаждениями кедра сибирского в различных лесорастительных условиях / Ф.Д. Аваров //Проблемы кедра. Экология кедровых лесов. – 1992. – №. 5. – С. 61-68. 44. Агроклиматический атлас России и сопредельных стран: экономически значимые растения, их болезни, вредители и сорные растения [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.agroatlas.ru/ru/index.html 45. Алпатьев, А.М. Физическая география СССР: Азиатская часть /А.М. Алпатьев //Высшая школа, 1976. - Т. 2.- 360 с. 46. Белоконь, М.М. Разработка микросателлитных маркеров сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica Du Tour) по результатам полногеномного de novo секвенирования /М.М. Белоконь, Д.В. Политов, Е.А. Мудрик и др. // Генетика. 2016. - том 52, № 12, С. 1418–1427. 47. Бобров, Е.Г. Лесообразующие хвойные СССР / Е.Г. Бобров // Л., 1978. - 188 с. 48. Будорагин, В.А. Типы аномальных пыльцевых зерен сосны обыкновенной / В.А. Будорагин, А.И. Бреусова //Половая репродукция хвойных. Новосибирск: Наука. – 1973. – С. 100-103. 49. Велисевич, С.Н. Семенная продуктивность Pinus sibirica (Pinaceae) в заболоченных и суходольных экотопах юга Западной Сибири / С.Н. Велисевич, О.Г. Бендер, А.П. Зотикова //Растительные ресурсы. – 2011. – Т. 47. – №. 2. – С. 1-14. 50. Велисевич, С.Н. Формирование структуры популяций сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica Du Tour) в заболоченных экотопах юга Томской области /С.Н. Велисевич, Е.А. Петрова, О.Г. Бендер и др. //Вестник Томского государственного университета. Биология. – 2008. – №. 1 (2). С. 13–22. 51. Власенко, В.И. Структура и динамика лесной растительности заповедных территорий Алтае-Саянской горной страны : дис./В.И. Власенко. - Красноярск: Институт леса СО РАН, 2003. 484 с. 52. Воробьев В.Н. Рост и пол кедра сибирского/В.Н. Воробьев, Н.А. Воробьева, С.Н. Горошкевич – Новосибирск: Наука, 1989. 167 с. 53. Воробьев, В.Н. Особенности плодоношения кедра сибирского в горных условиях / В.Н. Воробьев //Биология семенного размножения хвойных в Западной Сибири. Новосибирск: Наука. – 1974. – С. 15-70. 54. Горошкевич, С.Н. Внутрипопуляционное разнообразие шишек и семян Pinus sibirica Du Tour. Сообщение 1. Уровень и характер изменчивости признаков / С.Н. Горошкевич, О.В, Хуторной // Растительные ресурсы. 1996. Т. 32, № 3. С. 1–11. 55. Горошкевич, С.Н. Морфогенез жизненной формы стланца у кедра сибирского на верхнем пределе распространения в горах Западного Саяна / С.Н. Горошкевич, Е.А. Кустова // Экология. – 2002. – №. 4. – С. 243-249. 56. Горошкевич, С.Н. О морфологической структуре и развитии побегов Pinus sibirica (Pinaceae) /С.Н. Горошкевич //Ботанический журнал. – 1994. – Т. 79. – №. 5. – С. 63-71. 57. Горошкевич, С.Н. Структура урожая семян в таежных и припоселковых кедровниках: уровень, характер и природа различий / С.Н. Горошкевич //Лесное хозяйство. – 2010. – №. 2. – С. 30-31. 58. Горчаковский, П.Л. Фитоиндикация условной среды и природных процессов в высокогорьях /П.Л. Горчаковский, С.Г. Шиятов – Наука, 1985. 59. Дюкарев, А.Г. Припоселковые кедровники как объект охраны и реконструкции / А.Г. Дюкарев, Н.Н, Пологова, С.А. Кривец и др. // Вестник Томского гос. ун-та. Биология, 2009. № 2 (6). С. 75–83. 60. Ефремов, С.П. Биологическая продуктивность и углеродный пул фито- массы лесных болот Западной Сибири / С.П. Ефремов, Т.Т. Ефремова, В. Блойтен // Сиб. экологический журн. 2005. - № 1. С. 29–44. 61. Ефремов, С.П. Влияние осушения низинных болот на рост кедра сибирского / С.П. Ефремов. - Лесоведение, 1967. 62. Зауер, В.В. Морфология пыльцы Gymnospermae-голосеменных растений /В.В. Зауер //Пыльцевой анализ. Л. – 1950. – С. 154. 63. Захаров-Гезехус, И.А. Цитоплазматическая наследственность / И.А. Захаров-Гезехус // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2014. - Т. 18, № 1. - С. 93–102. 64. Калько Г.В. ДНК-маркеры для оценки генетических ресурсов ели и сосны / Г.В. Калько // Труды Санкт-Петербургского научно-исследовательского института лесного хозяйства. - 2015. - № 4. - С. 19-34. 65. Кожевников, А.М. Плодоношение кедра сибирского в западной части Забайкалья / А.М. Кожевников //Труды Ин-та леса и древесины. – 1963. – Т. 62. – С. 76-93. 66. Крутовский, К.В. Генетическая изменчивость сибирской кедровой сосны Pinus sibirica Du Tour. Сообщение IV. Генетическое разнообразие и степень генетической дифференциации между популяциями / К.В. Крутовский, Д.В. Политов, Ю.П. Алтухов и др. // Генетика. 1989. - Т. 25. № 11. С. 2009–2032. 67. Куминова, А.В. Растительность Кемеровской области / А.В. Куминова //Новосибирск, 1950. - 167 с. 68. Маскаев, Ю.М. Леса / Ю.М. Маскаев // Растительный покров Хакасии. - Новосибирск, 1976. - С. 153 - 216. 69. Матвеева, Т.В. Молекулярные маркеры для видоидентификации и филогенетики растений / Т.В. Матвеева О.А. Павлова, Д.И. Богомаз и др. // Экол. генетика. - 2011. - Т. IX. - С. 32–43. 70. Мудрик, Е.А. Генетическая изменчивость и дифференциация сибирской и европейской кедровых сосен по микросателлитным локусам / Е.А. Мудрик, М.М. Белоконь, Ю.С. Белоконь и др. // Популяционная генетика: современное состояние и перспективы: Материалы Междунар.молодежной конф. М.: Цифровичок, 2011. С. 225–226. 71. Мудрик, Е.А. Генетическая изменчивость и доля перекрестного опыления Pinus cembra L. в Украинских Карпатах и Австрийских Альпах по аллозимным и микросателлитным локусам / Е.А. Мудрик, М.М. Белоконь, Ю.С. Белоконь и др. //Лесной вестник/Forestry bulletin. – 2012. – №. 1 (84). 72. Мудрик, Е.А. Генетическая изменчивость кедровых сосен Европы и Сибири по данным микросателлитных локусов / Е.А. Мудрик, М.М. Белоконь, Ю.С. Белоконь и др. // Актуальные проблемы прикладной генетики, селекции и биотехнологии растений: Материалы Междунар. науч. конф. Ялта, 2009. С. 47. 73. Некрасова, Т.П. Биологические основы семеношения кедра сибирского / Т.П. Некрасова. Новосибирск: Наука, 1972. - 272 с. 74. Николаева, С.А. Жизненные формы Pinus sibirica (Pinaceae) в лесотундровом экотоне Северо-Чуйского хребта (Центральный Алтай) / С.А. Николаева, Е.О. Филимонова //Растительный мир Азиатской России. – 2016. – №. 1. – С. 16-23. 75. Орешкова, Н. В. Изменчивость ядерных микросателлитных локусов в популяциях кедрового стланика (Pinus pumila (Pallas) Regel) из российской части ареала / Н.В. Орешкова, В.П. Ветрова, С.Н. Горошкевич и др. //Генетика. – 2017. – Т. 53. – №. 3. – С. 324-333. 76. Орешкова, Н.В. Генетическая структура и дифференциация болотных и суходольных популяций сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica Du Tour) по ядерным микросателлитным локусам / Н.В. Орешкова, Т.С. Седельникова, А.В. Пименов и др. // Генетика. 2014. - том 50, № 9, с. 1059–1066. 77. Орешкова, Н.В. Методы молекулярно-генетических исследований [Электронный ресурс]: учеб.-методическое пособие к лабораторным занятиям / Н.В. Орешкова, И.Е. Ямских. – Красноярск: Сиб. федеральный ун-т, 2018. Режим доступа: http://Lib3.sfu-kras.ru/ft/LIB2/ELIB/b28/i-930815313.pdf 78. Петрова, Е.А. Генетическое разнообразие кедра сибирского Pinus sibirica Du Tour: распределение вдоль широтного и долготного профилей / Е.А. Петрова, С.Н. Горошкевич, М.М. Белоконь и др. //Генетика. – 2014. – Т. 50. – №. 5. – С. 538-538. 79. Петрова, Е.А. Распределение аллозимной изменчивости у кедра сибирского: три уровня разнообразия / Е.А. Петрова, С.Н. Велисевич, Д.В. Политов и др. // Хвойные бореальной зоны. 2010. Т. XXVII. № 1–2. С. 160–168. 80. Политов, Д.В. Характеристика генофондов популяций кедровых сосен по совокупности изоферментных локусов / Д.В. Политов, К.В. Крутовский, Ю.П. Алтухов // Генетика. 1992. - Т. 28. № 1. С. 93–114. 81. Седых, В.Н. Формирование кедровых лесов Приобья/ Н.В. Седых. - Новосибирск: Наука, 1979. - 110 с. 82. Тахтаджян, А.Л. Высшие растения, т.1. От псилофитовых до хвойных / А.Л. Тахдаджян. - М., Л.: Изд. АН СССР, 1956 - 485 с. 83. Хлесткина, Е.К. Молекулярные маркеры в генетических исследованиях и в селекции / Е.К. Хлесткина // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2013. - Т. 17, № 4/2. - С. 1044–1054. 84. Храмов, А.А. Необычная форма Pinus sibirica (Rupr.) Mayr на верховом болоте / А.А. Храмов, В.И. Валуцкий // Ботан. журн. 1970. - Т. 55. № 2. С. 280–284. 85. Хуторной, О.В. Экологическая изменчивость морфоструктуры кроны кедра сибирского на верхней границе распространения / О.В. Хуторной, С.Н. Велисевич, В.Н. Воробьев // Экология. 2001. - № 6. С. 427–433. 86. Шиманюк, А.П. Дендрология / А.П. Шиманюк. - Москва: Лесная промышленность, 1974 - с.264 - с 62. 87. Шиятов, С.Г. Дендрохронология верхней границы леса на Урале / С.Г. Шиятов. - М.: Наука, 1986. - 136 с.

1 ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА PINUS L. 1.1 Морфологическая характеристика Сосна - это крупное хвойное дерево, достигающее высоты 40-50 м и диаметра ствола до 2-4 м. Длительность жизни в среднем около 350-500 лет [51, 87]. Форма кроны видоизменяется в зависимости от возраста и может быть ширококонической, яйцевидно-притупленной или зонтиковидной. Кора стволов изменяется от гладкой, с малым количеством трещин, в раннем возрасте до более толстой, темно-серого цвета, с большим количеством трещин у взрослых деревьев. Для представителей данного рода характерно правильное моноподиальное ветвление [8]. Побеги двух типов - удлиненные (ауксибласты) и укороченные (брахибласты). На брахибластах хвоя располагается пучками по 2-3 или 5 (у отдельных видов от 1 до 8) хвоинок. Ауксибласты покрыты бурыми чешуйками, в пазухах которых располагаются сильно укороченные побеги. Морфологическое строение ростовых материнских почек ауксибластов является более сложным, чем у других родов [47, 86]. Первая хвоя распускается перед окончанием роста ауксибластов. Полное охвоение побегов происходит значительно позже, чем у других хвойных пород: в начале - первой половине лета [81]. Хвоя сосны колючая, узкая (1-2 мм шириной), различающаяся по длине у разных видов: от 2-5 до 45 см (сосна болотная). По количеству хвоинок в пучке сосны делятся на двуххвойные, треххвойные и пятихвойные. В поперечном сечении хвоя различна, для двухвойных наиболее характерно плосковыпуклое сечение, у трех-пятихвойных - ромбическое. Продолжительность жизни хвоинок от 2-3 до 6-11 лет, что зависит от видовой принадлежности и условий среды [8]. Отмирание хвои может происходить в любые сезоны года, при этом опадая пучками вместе с брахибластами.