1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Биологические особенности нематод
Класс нематод характеризуется общими биологическими признаками - признаками биологического прогресса. Распространение нематод обширно. Нематоды (нема- нитка, oides- подобный), отмечается внешнее строение животных данной группы.
Наука не знает таких сред обитания, в которых не было бы нематод. Морские глубины северного и южного полюса заселены огромным количеством видов и особей нематод, так же как солоноватые водоемы. Затем нематоды проникли в почвенные воды и стали компонентами почвенной фауны. Органические останки растений и животных подвергаются гниению, подобные очаги являются наиболее доступными источниками питания для нематод. Так сформировалась богатая видами группа сапробиотических нематод. Именно эта группа стала источником развития других групп нематод, перешедших к паразитическому существованию за счет организмов животных и растений. Сформировавшиеся два рода и вида нематод, приспособились к паразитированию в органах человека и животных, а так же в органах растений. В 100 см3 почвы насчитывается более 4500 шт. нематод, разнообразие видов напрямую зависит погодных условий и почвы. Порядка 85 % нематод находится в почвенном покрове, относительно микроорганизмов. Нематоды смогли приспособиться к жизни в других организмах [15].
Размер нематод на столько мал что порой их можно рассмотреть только при помощи микроскопа. Плотное изучение нематод началось лишь в 19 веке учеными Дюжарден, Бастиан, Де Ману. Которыми в начале были открыты некоторые виды нематод.
Биотопы нашей планеты, все среды жизни, возможно, почти все многоклеточные животные и растения оказались средой обитания нематод. Это один из наиболее ярких примеров биологического прогресса. Общее число видов нематод в настоящее время еще не выяснено наукой. Американский специалист по изучению нематод Н. А. Кобб (N.A.Cobb) полагал, что общее число видов нематод - свободных и паразитических - приближается к одному миллиону.
Номенклатура галловых нематод долгое время вызывала споры и противоречия. Поначалу мелойдогинид не выделяли в отдельное семейство, объединяя их в одном семействе разнокожих нематод (Heteroderidae) с цитообразующими нематодами.
Многочисленные исследования выявили, что круг растений-хозяев вредителя, определявшегося как один вид, насчитывает более 2000 видов.
Одновременно были установлены различные реакции популяций нематод из разных географиических местностей на одни и те же виды растений.
Пристальное изучение морфологии и биологии различных видов галловых нематод ставило под сомнение их принадлежность к семейству разнокожих нематод (Heteroderidae). Только появление возможности провести глубокий анализ ДНК вредителей поставило точку в вековом споре.
Молекулярная филогения доказала неродственные отношения между цитообразующими и галловыми нематодами, наглядно продемонстрировав, что седетарный паразитизм возник у этих двух групп независимо друг от друга. Так ранее существующий род был выделен в отдельное семейство Meloidogynidae.
По последним данным, семейство Meloidogynidae включает в себя три рода: Meloidogyne, Hypsoperine, Meloinema. Типовой род – Meloidogyne, типовой вид – Meloidogyne exigua [1].
Вполне вероятно, что дальнейшие исследования в области молекулярного анализа приведут к новым уточнениям систематики по различным трибам и приведут к созданию более точной классификации.
Имаго. Наряду с общими морфологическими признаками для всех нематод, мелойдогиниды имеют ряд признаков, отличающих представителей этого семейства.
Для определения галловых нематод в первую очередь используется различие в рисунке кутикулы в области вульвы и ануса (перинеума, или перинеальной области) у зрелых самок.
При рассматривании заднего конца тела самок видно горизонтально расположенное отверстие вульвы и над ним небольшой круглый анус, окруженные многочисленными кутикулярными бороздками.
Эти бороздки волнообразны и расположены в виде дуг вокруг ануса и вульвы. Кутикулярные бороздки по бокам прерываются боковыми линиями или сменяются короткими полосами. Фазмиды (органы, расположенные по бокам хвоста) часто заметны в виде небольших точек, сильно преломляющих свет.
Рисунок 1 – Взрослая особь нематоды
Самка, как и у всех представителей отряда Tylenchida, раздутая, удлиненно-овальная, лимоновидной либо шарообразной формы, с погруженным в ткань корня головным концом.
Самец в популяциях некоторых видов может отсутствовать. Как и у всех Tylenchida, имеет типичную червеобразную форму, как правило, не питается. Стилет развит, пищевод дифференцирован.
Яйцо, как и у всех фитонематод, удлиненно-овальной или почковидной формы. Размер яиц относительно крупный. Они часто практически равны диаметру тела самки. Яйца покрыты сложной многослойной оболочкой и содержат в цитоплазме небольшое количество желтка.
Личинка. Сформировавшаяся личинка схожа со взрослой нематодой, отличаясь от нее недоразвитой половой системой. Личинка обладает мощным наружным скелетом в виде кутикулы.
Имаго – облигатные корневые паразиты высших растений. Половой диморфизм четко выражен. Самцы подвижные или отсутствуют. Самки неподвижны. Питаются и размножаются внутри корня.[4]
Период спаривания. Часто самцы для сохранения вида не обязательны, и у многих представителей семейства размножениепроисходит партеногенетическим путем. Самка выделяет желатинообразное вещество (яйцевой мешок), в которое и откладывает яйца. За репродуктивный период (2–3 месяца) самка способна отложить до 2500 яиц.
Яйцо. Эмбриональное развитие идет по пути полного, равномерного, детерминированного дробления по билатеральному типу. Может начаться как еще в половых путях самки, так и после откладки яйца во внешнюю среду.
Личинка. Цикл развития личиночной фазы начинается еще в яичной оболочке (как и у всех нематод).
После линьки из яйца выходит личинка второго возраста с хорошо развитым стилетом. На этой стадии личинки являются инвазионными и проникают из почвы в зону роста ткани корня. При проникновении в корень личинки прокалывают клетку при помощи стилета и секретируют ферменты, вызывающие деградацию стенок клетки.
Рисунок 1 – Ротовая полость взрослой особи нематоды
После проникновения в корень личинка продвигается к центральному цилиндру. Миграция личинок галловых нематод проходит по межклеточному пространству – интерцеллюлярно, и, достигнув окончательного места локализации, они располагаются параллельно центральному межклеточному цилиндру (стелю) и теряют подвижность. Одновременно в результате секреторной деятельности формируется зона питания – особые структуры, обеспечивающие питание паразита (гигантские клетки и синцитий).
После формирования мест питания личинки трижды линяют и претерпевают ряд морфологических изменений: увеличиваются в размерах и изменяют форму тела. Самки из червеобразных становятся лимоновидной или грушевидной формы.
Происходит и внутренняя перестройка: кишечник редуцируется, в полости тела формируется яичник с яйцами.[4]
Наиболее устойчивая криптобиологическая фаза – инвазионная личинка второго возраста. Она способна сохранять жизнеспособность даже при отсутствии растения-хозяина от 8 до 12 месяцев.
Механизм возникновения галлов. В процессе гипертрофии и аномалии клеточного деления формируется структура нескольких гигантских клеток, которые характеризуются следующим образом: ядра лопастные, вздутые, число ядер может достигать 100, ядрышки увеличены, цитоплазма гранулирована, электронно-плотная, вакуоли маленькие или вообще отсутствуют, стенки утолщены неравномерно, с врастаниями внутрь клетки, количество митохондрий и пластид сильно увеличено. Цитоплазма этих клеток содержит липиды, нуклеиновые кислоты, белки. При этом последняя составляющая в 10 раз превышает норму. В оболочке гигантских клеток обнаружены целлюлоза и пектин, но отсутствует лигнин, суберин и крахмал. Некоторые из них содержат многочисленные вакуоли.
Основное назначение гигантских клеток и синцития – обеспечение оптимальных условий для питания и развития нематод. При этом продолжительность развития инвазионной личинки второго возраста нематод полностью совпадает с длительностью развития питающих структур, то есть личинки второго возраста полностью несут ответственность за их образование.
Клетки растений, окружающие зоны питания нематод, делятся и разбухают, что и приводит к образованию галлов. Возникновение и развитие галлов тесно связано с жизнедеятельностью галловых нематод. Примерно через неделю после последней линьки самки галловых нематод начинают выделять желатиновый матрикс, в который и откладывают яйца. Галловым нематодам, паразитирующим на культурах в теплицах, присущи три особенности, превращающие их в первостепенных вредителей растений:
• высокий инвазионный потенциал (плодовитость до 2500 яиц);
• развитие от 1 до 13 поколений за год в зависимости от вида и климата;
• наличие устойчивой к неблагоприятным внешним факторам криптобиологической стадии (личинка второго возраста).
На подходящем растении-хозяине нематоды семейства мелойдогинид способны полностью реализовать даже несколько жизненных циклов, не покидая ткани растения-хозяина, а только мигрируя вдоль проводящей системы корня, а иногда и по всему растению. Такой процесс наблюдается на суккулентах, узамбарских фиалках, бегониях и некоторых толстянках.
Нематоды семейства Meloidogynidae распространены по всему свету. Оптимальные климатические условия существования видов создаются в теплых и влажных районах местообитания.
В северных странах Европы наибольшая вредоносность видов семейства наблюдается в условиях закрытого грунта.
На территории европейской части РФ отмечают только пять видов нематод этого семейства.
1.2 Особенности морфологии, анатомии и физиологии
нематод овощных культур
Нематоды различны по размерам и каждая из них соответствует именно тому образу жизни, где они обитают:
1) листовая и нитевидная формы, живет в межклеточном пространстве листьев;
2) галловые нематоды, располагаются на корнях растений;
3) нематоды, которые нарушают структуру ткани, почвенные нематоды;
4) криконематоды способны укорачивать тело..
Рисунок 1 - Онтогинез личиночных стадий галловой нематоды в ткани корня: А – инвазионная личинка, Б – личинка второго возраста, В – личинка третьего возраста, Г – личинка четвертого возраста
Длина тела составляет 0,7-0,9 мм. Тело и форма сильно варьирует от удлиненно цилиндрической, веретеновидной до мешковидной. Но все нематоды на одной из стадии их жизненного цикла имеют червеобразную форму. Самки некоторых групп нематод на определенном этапе их онтогенеза становятся малоподвижными, и приобретают шаровидную, грушевидную, лимоновидную или мешковидную форму.
Рисунок 2 – Строение взрослой особи нематоды (самка)
Туловище нематод состоит из плотной эластичной кутикулы, под ней слой гиподермы и затем расположение мышечных клеток. Способность сокращать определенные мышцы позволяет им принимать необходимое положение, при расслаблении тело становится прямым. Нематоды перемещаются по поверхности и в почве змеевидными движениями [10].
Форма тела нематод имеет важное значение при их идентификации. Например, представители подсемейства Rotylenchinae при фиксации свертываются в спираль и получили название "спиральных нематод", нематоды семейства Tylenchorhynchidae обычно принимают под- ковообразную форму, а особенность строения кольчатых нематод (сем. Criconematidae) позволяет легко их отличить от других нематод на предварительной стадии просмотра нематодофауны в чашке Петри – под бинокуляром.
Тело нематод очень ясно дифференцировано на три участка. Передний участок несет органы чувств, окоторых сказано выше, и ему соответствует передний отрезок кишечника передняя кишка. Второй отрезоктела соответствует средней кишке и включает, кроме нее, половые трубки. Третий — образует хвост, ограниченный на брюшной стороне тела заднепроходной щелью (анусом). Конец хвоста имеет у разных видов различную форму.
Важно отметить, что передний отдел имеет в своем отделе головной участок и глоточный. В центре имеется ротовое отверстие, зубы и головные бугры. На голове – органы чувств. В глоточном участке – пищевод (часть передней кишки). Середина тела (большая часть тела), в ней располагается средняя часть кишки и размещение половых желез и протоков. И третья часть тела с анальным отверстием.
Внешний покров туловища нематод – это кожно-мышечно-нервным слой.
Кутикула нематод – это неклеточный слой, который покрывает тело, которая бывает гладкой или кольчатой, без выростов или со сложно устроенными продольными и поперечными структурами на поверхности.
Одна из продольных структур – боковые поля, образованные в результате выпячивания узких продольных полос кутикулы, тянущихся вдоль тела. При этом выпуклые части тела получили название боковых валиков, а углубленные – боковых линий или инцизур. Центральная часть нервной системы нематод состоит из нервного кольца, окружающего пищевод в средней или передней области. От нервного кольца в переднюю и заднюю части тела отходят продольные нервы в разные органы.
Рисунок 3 - Строение нематод (на примере рода Tylenchorhychus)
С нервной системой связаны органы чувств: тангорецепторы (папиллы), амфиды, фазмиды, дейриды и комиссуры (цефалиды, гемизонид и гемизонионы). Фазмиды представляют собой поровидные образования, расположенные между линиями бокового поля в хвостовой части тола нематод. Форма и расположение фазмид варьирует и имеет важное таксономическое значение.
На основании наличия или отсутствия фазмид все нематоды разделяются на два подкласса Phasmidia (Secernentea) и Арhasmidia (Adenophorea).
Пищеварительная система - трубковидной формы и состоит из передней, средней и задней кишок. Передняя часть включает ротовое отверстие (стому) и пищевод.
Важное значение в систематике нематод имеет строение пищевода. Различают несколько главных типов пищевода. Самый простой по форме пищевод у нематод отряда Dorylaimida. У хищных нематод семейства Mononchidae пищевод целиком цилиндрический, а у большинства других представителей этого отряда он состоит из двух частей: лишенной мускулатуры передней части и раздутой мускулистой второй. Но и во втором случав пищевод по своей форме тоже является цилиндрическим. У других фитонематод отчетливо выражено 3 отдела пищевода: передний – корпус, средний – перешеек (или истмус) и задняя часть -кардиальный бульбус (или вздутие). Корпус, в свою очередь, может подразделяться на переднюю часть – прокорпус и расширенную заднюю часть – метакорпус [22].
Задний конец пищевода у многих видов заканчивается кардиом, отделяющим пищевод от кишечника. В кишечнике выделяют два отдела: средняя кишка и задняя. В последней находятся ректальные железы. Экскреторная система у нематод представлена экскреторным каналом, экскреторной железой и экскреторной порой. Следует отметить, что у многих нематод отряда Dorylaimida пора отсутствует, что имеет важное значение в диагностике видов. Половые органы у нематод расположены в средней и нижней частях тела. У самок они состоят из яичника, матки, вагины и женского полового отверстия – вульвы. У некоторых видов имеется две матки и два яичника. В этом случае половая система называется дидельфной (если один яичник, то монодельфной). Яичники – органы, производящие яйца. Половая система самца включает семенник, семенной пузырь, семяпровод и копулятивный орган – спикулу. У некоторых видов имеется рулек, с помощью которого происходит регуляция направления спикулы при выдвижении ее из клоакального отверстия. Кроме того у многих нематод на хвосте имеется бурса – боковые кутикулярные выросты, необходимые при копуляции, имеющие важное значение при идентификации видов.
Другие классы немательминтов представлены очень мелкими форма-ми, большая часть из них меньше 1 мм, более крупные формы
встречаются реже. Так же некоторые нематоды имеют маленькие формы. Представители Trichoderma minntum достигают всего 80 мк в
длину. Такие мелкие формы известны в морях и в почве, где встречаются
нематоды длиной 200—300 мк.
Однако наряду с этими микроскопическими формами известны
настоящие гиганты из мира нематод. Самки лошадиной аскариды достигают 37 см в длину. Свайниквеликан (Dioctophyme renale) длиной в 1 м, a Placentonema gigantissim паразит кашалота, этого огромного китообразного, по величине тела, напоминает удава, самки его до 8 с лишним
метров в длину.
Таким образом, у нематод наблюдается значительные колебания
длины тела — от 80 мк до 8 м. Эти колебания длины тела одно из
свидетельств многообразия тех сред жизни, которыми овладели нематоды.
Биологический прогресс характеризуется такими признаками:
1) Численным увеличением особей данной систематической (таксономической группы);
2) Захват новых сред обитания;
3) Возрастающее многообразие форм (подвидов, видов, родов и т.п.).
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА РАБОТЫ
2.1 Материал
Для данной работы был взят материал по сбору нематод, проведенные в приусадебных хозяйствах Курской области. Были обследованы 3 сельскохозяйственные культуры: картофель – Solanum tuberosum L., кормовая свекла – Beta vulgaris L., лук – Allium. Всего было собрано и проанализировано более 1702 растительных и почвенных проб (Таблица 1) .
2.2 Методика работы
Сбор проб проводили общепринятыми в фаунистических исследованиях маршрутным методом и стационарным.
Маршрутный метод использовали с целью изучения фауны нематод и распространения фитогельментов на указанных культурах. Обследование проводили в конце вегетации. На анализ брали по 5 растений с прикорневой почвой каждой культуры. Растения на посевах извлекали в 5 точках через одинаковые интервалы по диагонали поля в зависимости от его размеров. Каждую пробу помещали в полиэтиленовый пакет, прикрепляли этикетку. Число проб для каждой культуры составляло 9 (3 из вегетативной части, 3 из корневой системы, 3 из прикорневой почвы). Общее число проб, собранных маршрутным методом, 270.
Стационарный метод использовали для изучения динамики численности нематод лука и кормовой свеклы. Данное исследование проводили на приусадебных участках Курской области.
При стационарном методе сбора растения извлекали постоян¬но на одном и том же поле в определенных точках по диагонали через каждые 30 метров. В каждую фазу анализировали 10 растений с прикорневой почвой из 3 горизонтов (0-10, 10-20, 20-30 см). Число проб в каждой фазе было равно 50 (10 - из надземных органов, 10 - из подземных, 30 - из 3 горизонтов прикорневой поч¬вы). Таким образом, в течение вегетации культуры кормовой свеклы соответственно – 400 растительных и почвенных проб. Кроме того анализу на нематод подвергали почву перед посевом и после уборки данных культур. Пробы брали в тех же 10 точках из 3 горизонтов. Число почвенных проб было равно 240. Таким образом, в двух хозяйствах в 2018 году было собрано и проанализировано 940 растительных и почвенных проб. При взятии проб учитывали температуру воздуха и почвы, влажность почвы, предшественника, агротехниче¬ское состояние поля. Процент влажности вычисляли методом высу¬шивания в термостате [9].
2.3 Методы выделения, фиксации и приготов¬ления
препаратов нематод
После тщательного внешнего осмотра растений надземные ор¬ганы отделялись от корневой системы и в отдельности прополаски¬вались в чистой воде. Для выделения нематод из растений пользо¬вались известным модифицированным методом Бермана с экспозици¬ей 14-16 часов. Для этой цели надземные органы и корневую сис¬тему отдельно резали промытыми ножницами или ножом на мелкие куски (1-2 см) и затем из этой массы брали навеску по 25 г в чистую марлевую салфетку и опускали в воронку с водой, установ¬ленную на штативе, конец которой зажат зажимом Мора. Вышедшие из растений нематоды опускались на другой конец шланга к зажи¬му. Скопившихся таким образом нематод сливали в отдельную чис¬тую пробирку и фиксировали 4%-ным формалином.
Есть много методов извлечения нематод, но ни один из них не обеспечивает полного извлечения всех имеющихся гельминтов в пробе. Для обработки имеющихся в нашей работе поч¬венных проб мы избрали метод промывки [2].
Почвенные пробы брали вокруг корней исследуемого растения от 0 до 30 см глубины по 1 дм3 с каждого 10-сантиметрового го¬ризонта. Затем всю взятую почву перемешивали и брали навеску 25 см3. При исследовании динамики нематодофауны эту навеску брали с каждого см по горизонтам почвы.
Почвенную пробу объемом в 25 см3 помещали в стеклянный ци¬линдр и заливали водой, затем взмученную воду сливали в метал¬лическое сито для задержки крупных частиц почвы и других приме¬сей. После этого взмученную воду с нематодами пропускали через сито. Остаток в сите смывали небольшим количеством воды в специаль¬ный сосуд и фиксировали 4%-ным формалином. Было извлечено 1702 особей нематод.
Выделение цист с помощью цистовыделителей
Средний образец помещают в сосуд-смеситель, заполняют его водой до полного объема. Тяжелые минеральные частицы почвы оседают, а легкие органические и цисты по сливному желобу смываются на два сита. Верхнее сито с диаметром ячеек 2 или 3 мм задерживает крупные всплывшие частицы, а нижнее сито с диаметром ячеек 0,16 мм – мелкие частицы и цисты. Образец промывают до появления чистой воды в сливном желобе. Продолжительность промывания зависит от объема почвенного образца и механического состава почвы.
Осадок с нижнего сита сливают на фильтр, вложенный в воронку, и после прохождения воды на фильтре остаются цисты.
После каждого образца приемную воронку, сосуд-смеситель и сита тщательно промывают чистой водой.
Методы определения жизнеспособности яиц и личинок
Для решения вопроса о наложении или снятии карантина с очага, а также определения эффективности мероприятия, примененного в борьбе с картофельными цистообразующими нематодами, необходимо знать не только о наличии цист в почве, но и о жизнеспособности яиц и личинок. Карантин накладывают только при наличии жизнеспособных яиц и личинок в обнаруженных цистах.
Визуальный метод
Для того, чтобы определить жизнеспособность яиц и личинок картофельных цистообразующих нематод, цисты разрезают и вычищают их содержимое в каплю воды на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом с увеличением не менее чем в 400 раз.
Жизнеспособные личинки имеют типичную червеобразную форму тела и ненарушенную структуру внутренних органов. Мертвые личинки часто имеют изогнутое, с резкими перегибами тело, для них характерна более резкая зернистость пищевода и вакуолизация внутренностей.
Метод окрашивания
Для определения жизнеспособности нематод методом окрашивания используют раствор малахитового зеленого в пропорции 50 мг продукта на 100 см? дистиллированной воды.
На предметное стекло в каплю воды помещают цисту, раздавливают ее препаровальной иглой и рядом с ней наносят каплю 0,05%-го водного раствора малахитового зеленого. Затем капли смешивают иглой и оставляют на 5 – 10 мин. На одно стекло можно помещать отдельно одну от другой несколько капель воды с цистами, но при этом необходимо нанести еще одну каплю воды без цисты, в которой после каждого раздавливания ополаскивают иглу, и тщательно ее вытирают, чтобы предотвратить возможность перенесения личинок из одной капли в другую.
После этого стекло устанавливают на предметный столик микроскопа с увеличением в 400 раз и рассматривают каждую каплю в отдельности. Мертвые личинки окрашиваются в интенсивно голубовато-зеленоватый цвет, а живые не окрашиваются, или же их окраска значительно отличается от мертвых по интенсивности [1,5,9].
