1 Литературный обзор
1.1 Биохимическая характеристика витамина В1 (тиамина)
В литературе описано знаменательное событие, когда рацион без витаминов стал виновником гибели людей. Капитан Военно-морского Бюро, К. Такаки отправил в рейс два корабля на девять месяцев. За этот промежуток времени матросов на первом корабле кормили мясом, свежими овощами, печеной рыбой. На втором корабле матросы и штурманы питались шлифованным белым рисом и свежей рыбой. На первом судне люди не заболели. Со второго судна с витаминной недостаточностью сошли около 200 человек, почти 100 человек погибло. Стало известно, что в еде был недостаток витамина В1. В оболочке семени риса имеется данный витамин. При полировке тиамин был удален. В начале XX века химик Каземир Функ сделал вывод, что в белом рисе отсутствуют необходимые полезные вещества. Сначала он их называл аминами и установил, что именно амины предотвращают развитие заболеваний [52].
Через год после своих предположений польскому химику удалось из отрубей риса избирательно извлечь тиамин в чистом виде. Для получения кристаллов тиамина потребовалось еще более 10 лет. Мелкие кристаллики витамина В1 не имеют цвета, неплохо растворяются в воде, отличаются горьким вкусом.
Первым витамином группы В является витамин В1, не образуется в организме человека, незаменим в клеточном обмене веществ.
Тиамин содержится в клетках растений и микроорганизмов. Большое количество обнаружено в дрожжах, в зерне пшеницы, ржи, ячменя [6, 15]. Разнообразные добавки к пище и обработка продуктов при высокой температуре разрушают витамин В1. Надобность человеческого организма в тиамине 2 – 3 мг в сутки. Остов формулы витамина В1 состоит из тиазола и пиримидина, которые соединены метиленовой группой (рисунок 1).
Рисунок 1 – Структурная формула молекулы витамина В1
Витамина В1 имеет специфическое строение. Образование тиамина идет несколькими путями: конденсацией пиримидинового и тиазольного компонента. При температуре 120 °C идет конденсация в толуоле или бутиловом спирте. Извлеченный тиамин отделяют из реакционной смеси осаждением, где чаще всего применяется ацетон, затем идет реакция перекристаллизации из метанола.
Для возмещения необходимости в витамине В1 применяется чистый тиамин и его распространенные производные, как тиамина гидрохлорид, пиритиамин, ацетилтиамин, ацефуртиамин, беклотиамин, фурсултиамин, сульбутиамин, бенфотиамин, винтиамол, тиамина дисульфид. Множественные формы витамина В1 обладают биологической доступностью и постоянством. Перечисленные выше формы способны накапливаться в различных тканях, биологических жидкостях организма, диффундировать через гематоэнцефалический барьер, стремительно преобразовываться в коферментную форму. Тиамина гидрохлорид, дисульфид, пиритиамин, при применении внутрь активнее аккумулируются в тканях мозга [18, 64].
В пищевых продуктах витамин В1 существует, главным образом, в виде тиамина, тиамина трифосфата, тиамина пирофосфата, который является первостепенным небелковым соединением многих белков. Главным механизмом биологического действия витамина В1 является активное участие тиамина пирофосфата как кофактора в ферментах, отвечающих за обмен аминокислот и образование АТФ. Доля поступившего с пищей тиамина в кишечнике всасывается методом инфильтрации. Следующий этап происходит в печени при участии тиаминфосфокиназы, происходит реакция фосфорилирования, образуются моно-, ди- и трифосфат тиамина. Наиболее активным считается таминпирофосфат (ТПФ) – коэнзим некоторых окислительно-восстановительных ферментов. ТПФ локализуется внутри клетки и является наиболее активной формой этого витамина, концентрация которого отражает общий уровень тиамина в организме. Наибольшее содержание ТПФ найдено в эритроцитах. Коферментная функция тиамина была открыта в 1937 году.
ТПФ-зависимая пируватдегидрогеназа принимает участие в окислительном декарбоксилировании пирувата с образованием ацетил-КоА, который окисляется в цикле Кребса до СО2 и Н2О с образованием молекул аденозинтрифосфата (АТФ).
Другой ТПФ-зависимый фермент – 2-оксоглутаратдегидрогеназа, катализирующая окислительное декарбоксилирование 2-оксоглутаровой кислоты с образованием янтарной кислоты, играющей важную роль в цикле Кребса. Тиаминпирофосфат принимает участие в окислительном декарбоксилировании альфа-кетокислот с разветвленным углеродным скелетом [36, 41].
Витамин В1 – единственный витамин, принимающая участие в энергетическом обмене, регулирующий деятельность центральной нервной системы (ЦНС), периферической нервной системы, сердечно-сосудистой и эндокринной систем. Тиамин уменьшает повреждения нейронов при окислительном стрессе, предотвращает повреждение сосудов при сахарном диабете, предупреждает развитие нефропатии. В состав большинства энзимов входит витамин В1. Наиболее значимым из ряда таких энзимов выступает транскетолаза [61]. Транскетолаза, в состав которой входит ТПФ-фермент пентозофосфатного цикла окисления углеводов, является основным источником восстановленного НАДФН и рибозо-5-фосфата. При дефиците тиамина имеет место быть недостаток транскетолазы. Следовательно, происходит увеличение в тканях и в крови молочной и пировиноградной кислот. Недостаточность ферментов приводит к замедлению трансформации углеводов в липиды, сокращается синтез стероидов, ацетилхолина, изнывает энергетический обмен. Замедление синтеза жиров, является последствием нехватки, простагландинов и лейкотриенов. Дефицит тиамина, вызывая блокаду превращения пирувата в ацетил-КоА, снижает образование АТФ и вызывает клеточный ацидоз с повышением уровня свободных жирных кислот.
Защитные свойства витамина В1 нельзя объяснить только его коферментными свойствами, влиянием на метаболизм ?-кетокислот, карбонильных соединений. Тиамин и его фосфорные эфиры ингибируют образование конечных продуктов гликозилирования белков также в опытах in vitro. Одним из возможных механизмов защитного действия тиамина является его взаимодействие с пероксинитритом. Пероксинитрит очень эффективно нитрирует фрагменты тирозина в некоторых энзимах, дезактивируя их. Тиамин вступает во взаимодействие с пероксинитритом, разрушая его. Эти процессы ведут к замедлению реакции нитрования тирозильных остатков белков. Также известно, что оксоферильные формы гемоглобина и тирозильные алкилы оксидируют тиамин, его фосфорные эфиры, оксодигидротиохром, тиаминдисульфид. Таким образом, можно предположить, что при окислительном стрессе уменьшается содержание тиамина в результате трансформации его в неактивные соединения. Важным звеном обмена лабильного пула тиамина и его фосфатов является тиаминзивный белок (ТЗБ), локализованный в плазматической мембране нервных клеток, а также тиаминкиназ, который осуществляет первое фосфорилирование тиамина с образованием TДФ.
После вырождения ТПФ тиамин претерпевает биологическую трансформацию. Возникает деметилирование пиримидинового кольца и конъюгация с цистеином. В удалении образовавшихся конъюгатов принимают участие почки.
В последние годы появились исследования, результаты которых свидетельствуют о том, что функции тиамина, как в отдельных клетках, так и в организме не ограничиваются его участием в качестве кофермента, необходимого для функционирования отдельных ферментов.
Создание классификации некоферментных эффектов тиамина предпринимались с 60-х годов ХХ века. Островский Ю.М. предложил классифицировать проявления некоферментных эффектов тиамина и тиаминфосфатов, исходя из способности этих веществ реагировать с различными биологически активными соединениями, благодаря наличию в их молекулах химически активных группировок. Были выделены три типа проявлений некоферментных свойств тиамина и ТПФ, которые обусловлены непосредственным взаимодействием этих соединений с другими биологически активными веществами. К первому типу он отнес взаимодействия с пирофосфатной группировкой ТПФ. Ко второму типу были отнесены взаимодействия с аминогруппой пиримидинового кольца. К третьему типу были отнесены процессы образования смешанных дисульфидов благодаря раскрытию тиазолового кольца.
Петров С.А. предложил систематизировать признаки некоферментных свойств тиамина и его продуктов обмена, применяя в качестве критерия особенность биохимических процессов, в которых демонстрируются эти эффекты тиамина.
Известны неферментативные взаимодействия тиамина и его метаболитов с другими веществами. Тиамин, благодаря наличию активных группировок, способен реагировать с целым рядом соединений. Например, тиамин может вступать в реакцию с полифенолами, реализуется in vitro, так и в некоторых клетках. Механизм реакции заключается в активации ионизированных полифенолов в присутствии кислорода и последующем катализе активными интермедиатами расщепления тиазолевого цикла ионом OH-, в результате чего образуется тиаминдисульфид.
Витамин В1 способен вступать в реакцию с соединениями, которые содержат альдегидную группу. В литературе, описана реакция между тиамином и альдегидом. Непосредственно, реакция идет с образованием водородной связи между аминогруппой и карбонилом ацетальдегида.
Тиаминпирофосфат способен вступать во взаимодействие с триптофаном, с некоторыми окислителями в клетке, с ионами металлов.
Очередной группой некоферментных свойств тиамина можно предполагать конкретные ступени его биологических и химических взаимодействие с другими витаминами, которые не взаимосвязаны с проявлением его коэнзимных функций.
Взаимодействие тиамина с пантотеновой кислотой в цитоплазме клетки известно с давних пор. Данное взаимодействие осуществляется в цитоплазме клеток с одной стороны между продуктами метаболизма тиамина – тиаминдисульфидом, с другой стороны пантотеновой кислотой или КоА. В результате реакции образуется тиаминтиол и дисульфид пантотеновой кислоты или КоА [19].
Витамин В1 также может оказывать некоферментное действие на обмен никотиновой кислоты и регулировать баланс рибофлавина в организме. В литературе найдены сведения о том, что введение тиамина и его метаболитов усиливает выведение рибофлавина с мочой. Тиаминпирофосфат на уровне терапевтических доз не оказывает влияния на выделение рибофлавина [17, 27].
Изучены биологические эффекты взаимодействия между витамином В1 и С. Тиамин принимает участие в синтезе аскорбиновой кислоты и способен защищать эту кислоту от окисления. Такое свойство витамина В1 сопряжено с тиазоловым кольцом. Тиазолевый элемент тиамина образуется в организме за счет тиаминазной реакции, проявляет подобное защитное воздействие. Пиримидиновый компонент тиазола похожего действия не вызывает.
Тиамин имеет свойство вступать в биохимическую реакцию с рутином in vitro и в результате реакции образуется рутинтиамин.
До настоящего времени вероятность некоферментного действия тиамина на активность ферментов, взаимодействие с продуктами катаболизма не привлекала внимание витаминологов и это объясняется традиционными представлениями о ведущей роли соединений тиамина как коферментов и обязательных участников ряда биохимических процессов в организме [1, 18].
Исследования последних двух десятилетий показывают, что некоферментные эффекты тиамина и его метаболитов оказывают непосредственное влияние на обмен веществ.
Некоферментное воздействие витамина В1 на обмен углеводов проявляется на этапе расщепления полисахаридов. Процесс всасывания углеводов зависит от тиазолевого фрагмента тиамина. В экспериментах in vivo ряд производных тиазола при внутривенном введении кроликам в 1,5 – 2 раза увеличивал всасывание глюкозы в двенадцатиперстной кишке, тонком и тощем кишечнике. Тиамин также способен активизировать гексокиназу и фофофруктокиназу при концентрациях, превышающих физиологические. Производные тиамина способны оказывать влияние на содержание гексоз, связанных с белками плазмы крови. Огромный интерес представляют исследования регуляции тиамином и его метаболитами уровня органических кислот, которые образуются в результате гликолиза и в цикле трикарбоновых кислот.
Некоферментное влияние тиамина на белковый обмен выявляется на уровне протеаз желудочно-кишечного тракта. С давних пор известно активирующее действие тиамина на пепсин и отсутствие влияния на трипсин. В исследованиях было продемонстрировано, что стимулирующим действием на пепсин обладает не сам тиамин, а его метаболит тиохром. Известна биологическая роль тиамина в переаминировании аминокислот. Существуют научные работы, где продемонстрировано притеснение трансаминаз под действием витамина В1 и нарастание деятельности ферментов при дефиците данного витамина.
Некоферментная роль тиамина установлена в обмене нуклеиновых кислот. Тиамин или тиазолевый ингредиент значительно понижает синтез мРНК от гена thi2, отвечающего за образование тиазола, и гена thi3, отвечающего за синтез пиримидинового элемента тиамина. Витамин В1 регулирует экспрессию некоторых генов, кодирующих синтез ТПФ-зависимых ферментов. Данные эффекты можно считать физиологическими, так как они достигаются при наномолярных концентрациях тиамина. Известно также прямое участие витамина в синтезе РНК в опухолевых клетках. В этом случае витамин В1 оказывал потенциирующее действие на процесс транскрипции.
В литературе найдено немного сведений по некоферментному влиянию тиамина на обмен липидов. Одним из примеров является способность витамина ингибировать липазу крови [18, 27].
Участие витамина В1 имеет место быть в процессах фосфорилирования и дефосфорилирования. Основная роль в данных процессах принадлежит тиаминфосфату. Сам тиамин и тиаминфосфаты обладают ингибирующим действием на щелочную фосфатазу. Данные эффекты являются физиологическими, поскольку наблюдаются только при высоких концентрациях тиамина. Тиамин способен стимулировать фосфорилирование мочевой кислоты.
Коштоянц Х.С. провел первые исследования некоферментных эффектов тиамина в нервной системе. Установил ингибирующее действие тиамина на ацетилхолинэстеразную активность. Определенные концентрации тиамина блокируют передачу возбуждения с нерва на мышцу. Отмечено, что тиамин в концентрациях 10-14 – 10-4 М усиливает секрецию медиатора нервными окончаниями, что обусловлено взаимодействием тиамина с рецептором, локализованным на пресинаптических нервных окончаниях [31].
Витамин В1 в различных дозах способен влиять на рост и биологические свойства микробных клеток. В составе питательной среды концентрации 5 и 1 мг/мл способны усиливать адгезивные свойства у E. coli. Эти же концентрации способны стимулировать рост C. albicans в жидкой питательной среде на 6 порядков.
Под влиянием тиамина происходит изменение антимикробной активности у молочнокислых бактерий и их ассоциаций. При концентрации тиамина 10 мг/100 мл снижение антагонистической активности в отношении E.coli установлено у L. plantarum 22, L. brevis Б-3 и ассоциации А, в отношении S. gallinarum – у Lactobacillus plantarum 22, ассоциации А, к Bacillus subtilis АТСС 6633 – у L. plantarum 22 и 2В, L. cellobiosus 20 и ассоциации П, к Staphilococcus aureus – у всех испытанных молочнокислых бактерий и их ассоциаций [16].
Под действием витамина В1 установлено повышение устойчивости у K. pneumoniae 444 к линкомицину, у S. gallinarum – к левомицетину, у B. subtilis АТСС 6633 – к левомицетину и линкомицину и потеря устойчивости у ассоциации А к гентамицину, P.shermanii-15 – к левомицетину, у L. cellobiosus 20 – к гентамицину, у L.plantarum 2B – к ципрофлоксацину, у L.brevis Б-3 – к бисептолу и левомицетину [49].
Тиамин в комплексе с витаминами В6 и В12 приводит к увеличению колоний E. coli, K. Pneumoniae 444, C. albicans на твердой питательной среде [16].
Анализируя литературу по данной теме, можно сделать вывод, что биологические эффекты тиамина в организме многообразны. Кроме коферментных и некоферментных эффектов в макроорганизме, тиамин еще способен оказывать действие на рост и биологические свойства микроорганизмов.
1.2 Биохимическая характеристика витамина С (аскорбиновой кислоты)
Витамин С был открыт в XIX веке отечественным патофизиологом В.В. Пашутиным. Аскорбиновая кислота эффективна при лечении цинги – заболевания, вызванного дефицитом свежих фруктов и овощей в пищевом рационе. Древние лекари писали, что цинга является инфекционным заболеванием. Позднее было отмечено полезное действие сбалансированного питания. В рационе обязательно должны присутствовать цитрусовые, растения из семейства крестоцветных и пасленовых. Ученые пришли к мысли о существовании в данных пищевых продуктах редкостного витамина против цинги. Такой эликсир жизни был обнаружен и был назван витамином С. Некоторые животные, обладают способностью синтезировать аскорбиновую кислоту (крысы, птицы). Существует также категория животных, получающих витамин С только с пищей (морские свинки, обезьяны). Витамин С не способен синтезировать и человек. В 1923 году аскорбиновую кислоту удалось выделить С. Зильва и А. Сент-Дьерди в виде кристаллов. Через четыре года окончательно была изучена природа этого витамина. Витамин С представляет собой белые кристаллы, которые отличаются острым кислым вкусом. Хорошо растворяется в воде, плохо или вовсе не растворяется в органических растворителях.
Аскорбиновая кислота состоит из двух атомов углерода, которые характеризуются ассиметричным строением. Представляет собой оптически активное соединение, образуя четыре оптических изомера и два рацемата (рисунок 2). Одним из активных стереоизомеров является L-аскорбиновая кислота. По химическим свойствам является слабой кислотой. Обусловлен слабокислотный характер присутствием двух обратимо диссоциирующих енольных гидроксилов. Структура витамина С напоминает шестиуглеродный сахар. Активная часть вещества представлен аскорбатным ионом, который может оказывать свойства кислоты или нейтральной соли (аскорбат) [47].
Рисунок 2 – Структурная формула молекулы витамина С
Синтез аскорбиновой кислоты осуществляется растительными и некоторыми животными клетками. Следует отметить, что в животном организме местом биосинтеза являются почки и печень. В ходе эволюции способность синтезировать витамин С впервые появилась у прародителей амфибий около 30 млн лет назад, когда впервые позвоночные вышли на сушу из воды, в богатую кислородом среду, и была потеряна у предшественников приматов приблизительно 25 мл назад. Биосинтез связан с образованием аскорбиновой кислоты из D-глюкозы, при этом не происходит разрыв углеродного скелета.
Витамин С образуется в микросомах печени некоторых представителей животного мира. У морских свинок, у человека, у некоторых приматов витамин С не синтезируется из-за отсутствия L-гулонооксидазы. Данный фермент ускоряет превращение гулоновой кислоты в аскорбиновую [21].
Витамин С в промышленных масштабах получают с выходом 50 % из D-глюкозы, используя микробиологический синтез.
Распад витамин С легко идет при нагревании, при добавлении щелочи, при действии кислорода, при участии ионов металла переменной валентности, катализирующих её окисление с образованием неактивных продуктов.
Влияние аскорбиновой кислоты на обменные процессы в организме исследована мало. Известно, что витамина С в реакции ферментативного гидроксилирования выступает в роли кофактора. При этом фрагменты пролина и лизина в коллагене соединительной ткани высших животных переходят в остатки 4-гидроксопролина и 5-гидроксолизина, которые обнаружены исключительно только в коллагене. В любом другом белке животных их нет. Витамин С принимает непременное участие в возникновении основного компонента соединительной ткани животных, активизирует рубцевание ран, но еще не известны все функции антицинготного витамина [50].
В литературе можно встретить достаточно сведений о том, что аскорбиновая кислота является мощным антиоксидантом, благодаря чему регулируются окислительно-восстановительные процессы в организме, тем самым предотвращая многие заболевания радикального происхождения. В клетках аскорбиновая кислота может также возобновить ?-токоферильный радикал. Альфа-токоферол приобретает свойства антиоксиданта. Аскорбиновая кислота обладает способностью восстанавливать другие антиоксиданты, такие как витамины А и Е [14].
Витамин С затмевает остальные антиоксиданты, содержащиеся в плазме, принимает участие в защите липидов от оксидирования, обладает достаточной реакционной способностью, чтобы эффективно ингибировать инициацию перекисного окисления липидов (ПОЛ) в водной фазе. Увеличение радикалов аскорбата и целиком оксидированной формы витамина С – дегидроаскорбата (ДАК) возникает в результате восстановления ?-токоферола. Благодаря способности аскорбиновой кислоты вступать в окислительно-восстановительные реакции в организме растений формируется система защиты. Химическая реакция аскорбата с кислородом разворачивается в две ступени. На первом этапе образуется монодегидроаскорбат. Первая молекула превращается в ДАК, вторая в аскорбиновую кислоту (АК). Лактоновое кольцо В молекуле аскорбиновой кислоты лактоновое кольцо устойчиво, а в ДАК можно наблюдать гидролиз, при котором образуется кислота с раскрытой цепью – 2,3-дикетогулоновой кислоты (2,3-ДКГК).
Если в составе имеются Fe2+, Fe3+ и Cu2+ аскорбат превращается в прооксидант. Мощное соединение восстанавливает эти ионы и вызывает разложение органических перекисей. Выше указанная реакция говорит о необходимости in vivo основательного отторжения свободных ионов металлов переменной валентности. Анти- или прооксидантные свойства витамина С зависят от плотности субстрата и условий протекания реакций в присутствии кислорода [14]. Максимальные концентрации витамина С приводят к усилению абсорбции железа, которая попадает в организм с пищей, вызывают высвобождение ионов Fe2+ из ферритина. У обследуемых с избыточным количеством ионов железа всегда оказывается невысокое содержание аскорбата. Введение витамина С парентерально считается чрезвычайно угрожающей жизни процедурой. Самым оптимальным способом введения является его инъекция с десфералом, которая впрыскивается одновременно. Существует предположение, что свойства аскорбиновой кислоты зависят от условий среды. Она может выступать высокоэффективным анти- и прооксидантом. Такая особенность витамина С важна для поддержания окислительно-восстановительного гомеостаза в биологических системах.
При участии витамина С уменьшается количество холестерина и обезвреживается множество токсичных соединений [65]. Витамин С является уникальным полифункциональным соединением, обладающим способностью обратимо окисляться и восстанавливаться, благодаря чему она принимает участие в важнейших процессах живой клетки [66].
Существует достаточное количество фундаментальных исследований, что аскорбиновая кислота активно влияет на состояние иммунной системы. Она стимулирует фагоцитарную активность макрофагов, пролиферативный ответ В- и Т-лимфоцитов, продукцию IL-2 и IL-6, увеличивает продукцию интерферона, усиливает продукцию высокоактивных форм и соединений кислорода [20]. В научной литературе отмечены свойства аскорбиновой кислоты локализоваться в нейтрофильных гранулоцитах, которые принимают непосредственное участие в ликвидации инфекции с вовлечением свободных радикалов. При этом сами нейтрофилы, содержащие аскорбиновую кислоту, защищены от повреждающего действия свободных радикалов [59].
Высокие концентрации витамина С могут стать причиной гипергликемии и чрезмерного выделения глюкозы с мочой. Дегидроаскорбиновая кислота является продуктом обмена веществ, которая затрудняет поступление глюкозы в ткани, ингибирует секрецию инсулина, одновременно стимулируя выделение глюкагона [60].
Витамин С может оказывать влияние на различные инфекции, вызываемые микроорганизмами [63] .
Фармацевтический рынок предлагает огромный выбор витаминов группы С в совершенно различных формах. Производные аскорбиновой кислоты являются одним из наиболее широко используемых антиоксидантов для защиты кожи.
Японскими учеными были проведены исследования с довольно редкой формой витамина С – цинка аскорбатом (Zinc ackorbate). Антимикробную активность аскорбата цинка in vitro тестировали самостоятельно, либо в сочетании с различными антимикробными агентами в отношении грамположительной бактерии Staphylococcus aureus и грамотрицательной бактерии Escherichia coli. Ряд авторов, считают, что полученные результаты дают новые доказательства, что аскорбат цинка может быть эффективным для лечения заболеваний кожи [62].
Ампульный раствор аскорбиновой кислоты применяют в изучении биологических свойств микроорганизмов. Ряд авторов установили что, витамин С стимулирует рост K. pneumoniae 444 в 10 раз по сравнению с контролем при его содержании в питательной среде 150 мг/100 мл. Стимулирование роста B. subtilis АТСС 6633 происходит в 2-3 раза при испытанных концентрациях, а клинических штаммов 1 и 2 – при концентрациях 150 мг/100 мл и 30 мг/100 мл. Особо следует отметить, что, в отличие от витаминов В1, В6, В9 и В12, витамин С не оказывает стимулирующего действия на рост C. albicans.
Установлено, что витамин С практически не оказывает влияния на рост молочнокислых и пропионовокислых бактерий, за исключением стимулирования роста на 1 порядок у L. brevis
